重慶市艾滋病患者新型隱球菌臨床分離株基因分型和臨床特點(diǎn)分析

李曉旭，曹培明，胡永芳，楊 坤，何 靜，李小鳳，劉 敏，周 剛，廖國建，李同心

新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）是致命的病原真菌之一，每年在全球引起超過100萬例感染[1]。免疫缺陷患者，尤其是HIV感染和艾滋病患者，是新型隱球菌感染的主要人群。在HIV高流行區(qū)，新型隱球菌性腦膜炎發(fā)病率高，且預(yù)后差；即使通過藥物治療，新型隱球菌感染的死亡率仍然高達(dá)30%～95%[1-2]。

隱球菌屬至少有30多個(gè)種，其中具有致病性的絕大多數(shù)為新型隱球菌和格特隱球菌，我國以新型隱球菌感染為主[3]。有學(xué)者對亞洲新型隱球菌菌種分布與構(gòu)成的研究顯示我國華北、華東地區(qū)的新型隱球菌臨床株以ST5型為主[4-5]。本研究旨在分析重慶市艾滋病患者臨床分離新型隱球菌的基因型，了解新型隱球菌的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，同時(shí)對相關(guān)的臨床資料進(jìn)行總結(jié)，分析主要型別菌株感染患者的臨床癥狀、預(yù)后等特點(diǎn)，為新型隱球菌病的預(yù)防、診斷、治療提供更加科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究資料

1.1.1 研究對象 收集重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心感染科住院部2017年3月1日—2018年7月31日送檢的艾滋病患者行真菌培養(yǎng)的體液標(biāo)本共1 063份。艾滋病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國艾滋病診療指南（2018版）》[6]。本研究取得所有患者知情同意和重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心學(xué)術(shù)倫理委員會批準(zhǔn)。本研究試驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株H99(ATCC 208821)為西南大學(xué)藥學(xué)院贈與。

1.1.2 患者臨床特征 收集患者一般資料（姓名、性別、年齡、職業(yè)、婚姻狀況、民族等）、基礎(chǔ)疾病（糖尿病、結(jié)核病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎病綜合征、慢性支氣管炎等）、臨床癥狀、檢驗(yàn)結(jié)果（血常規(guī)、腦脊液生化等）、影像學(xué)檢查表現(xiàn)以及轉(zhuǎn)歸情況等臨床信息。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本分離培養(yǎng)、鑒定和藥敏 痰液、纖維支氣管鏡灌洗液的真菌分離培養(yǎng)使用沙保弱培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA），35℃培養(yǎng)5～7 d，菌株傳代接種于SDA，35℃培養(yǎng)24～48 h，挑取純的單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定與抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)。血液、腦脊液、胸水等采用美國BD BACTECTMFX 200全自動血液培養(yǎng)儀和配套的真菌培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，待儀器報(bào)陽后轉(zhuǎn)種SDA，35℃培養(yǎng)24 h，挑取純的單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定與藥物敏感性試驗(yàn)。新型隱球菌的鑒定與最低抑菌濃度 （MIC）藥敏使用Thermo Scientific 生產(chǎn)的SENSITITRE ARIS 2X 微生物鑒定、藥敏分析系統(tǒng)及配套的鑒定藥敏試劑盒，按照試劑盒說明書完成對菌種的鑒定和隱球菌對兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑5種抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn)，MIC判讀參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2012年 M27-S4中念珠菌標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 菌株保藏、培養(yǎng)與復(fù)蘇 將新型隱球菌分離株從分離平板上刮取足夠菌體至含有20%甘油保種管中，混勻并放于-80℃保藏。活化菌株時(shí)，挑取適量凍存菌體至SDA平板上培養(yǎng)24 h以上，待平板上長出菌體進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 隱球菌基因組DNA的提取 用氧化芐法提取隱球菌臨床株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，提取所得的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 基因型鑒定 按照文獻(xiàn)用血清型和交配型特異性引物（STE20Aa、STE20Aα、STE20Da和STE20Dα）對患者入院首次分離的54株新型隱球菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。

1.2.5 PCR擴(kuò)增 參照國際人與動物真菌學(xué)會（ISHAM）共識方案，選取新型隱球菌的7個(gè)管家基 因CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1、URA5進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7-8]。

1.2.6 隱球菌基因分型 利用提取的54株臨床菌株的基因組，對新型隱球菌上述7個(gè)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化、測序，將測序結(jié)果按照數(shù)據(jù)庫的要求進(jìn)行校正，校正后符合數(shù)據(jù)庫要求的序列提交至數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（National Center for Biotechnology Information）獲得GenBank登錄號并通過新型隱球菌/格特隱球菌復(fù)合群數(shù)據(jù)庫（http://mlst.mycologylab.com）確定每株菌的序列型ST型。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用醫(yī)院信息系統(tǒng)（HIS，上海瑞美電腦科技有限公司）檢索統(tǒng)計(jì)原始檢驗(yàn)結(jié)果；采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；應(yīng)用BioNumerics軟件進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（MLST）。采用率或構(gòu)成比（%）進(jìn)行計(jì)數(shù)資料描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株收集

1 063 份體液標(biāo)本行真菌培養(yǎng)分離出致病真菌619株，其中189株初步鑒定為新型隱球菌，體液標(biāo)本類型含有腦脊液148份、血液40份、胸水1份。由于菌株復(fù)蘇失敗或同時(shí)混有其他致病菌、臨床資料不全等原因，最終獲得來自54例艾滋病患者分離的149株菌株有效。納入本研究統(tǒng)計(jì)分析中54株新型隱球菌為患者入院首次分離的菌株，其原始標(biāo)本類型分別為腦脊液38份、血液15份、胸水1份。

2.2 臨床資料

2.2.1 一般資料 54例艾滋病患者現(xiàn)居地均為重慶市，男42例，女12例，男女比1∶0.3；年齡為11～75歲，平均（45.0±14.5）歲。從發(fā)病至就診的間隔時(shí)間為2～60 d，平均（18.3±16.1）d。平均住院天數(shù)（26.5±14.5） d（1～53 d）。轉(zhuǎn)歸：好轉(zhuǎn)38例（70.4%），病情無改善16例（29.6%）。

2.2.2 臨床表現(xiàn)與出院診斷 54例患者入院時(shí)臨床表現(xiàn)以發(fā)熱為最多見，占88.9%（48/54）。12例有基礎(chǔ)性疾病，占22.2%（12/54），基礎(chǔ)性疾病主要為：2型糖尿病2例，高血壓2例，肺結(jié)核1例，結(jié)核性胸膜炎1例，慢性乙肝4例，腦動脈血栓1例，痛風(fēng)1例。出院診斷均有“新型隱球菌性腦膜炎”。

2.2.3 入院首次實(shí)驗(yàn)室檢查

2.2.3.1 血細(xì)胞檢查 54例艾滋病患者中32例（59.3%）血常規(guī)檢查白細(xì)胞在正常范圍內(nèi)；5例（9.3%）淋巴細(xì)胞在正常范圍內(nèi)，38例（70.4%）淋巴細(xì)胞＜1.1×109/L。

2.2.3.2 HIV-1病毒載量檢查 54例患者HIV-1病毒載量平均值（326 152.6±109 395.4）拷貝/mL；7例（13.0%）HIV-1病毒載量檢測正常（＜40拷貝/mL）。

2.2.3.3 CD4+T淋巴細(xì)胞檢查 54例患者CD4+T細(xì)胞絕對值檢查均＜200.0/μL，最低值3.0/μL，最高值155.0/μL，平均（33.5±4.8）/μL。

2.2.3.4 腦脊液常規(guī)及生化檢查 53例患者有腰穿腦脊液記錄，腰穿腦脊液壓力中位數(shù)為190 mmH2O，22例（41.5%）腦脊液壓力在正常范圍內(nèi)。腦脊液總蛋白檢測平均值（964.9±96.4）mg/L，11例（20.4%）腦脊液總蛋白在正常范圍內(nèi)。腦脊液氯化物檢測平均值（118.1±2.4）mmol/L，24例（44.4%）腦脊液氯化物在正常范圍內(nèi)。腦脊液葡萄糖檢測平均值（2.4±0.2）mmol/L，21例（38.9%）腦脊液葡萄糖在正常范圍內(nèi)。

2.2.3.5 新型隱球菌特異性檢查 48例患者進(jìn)行腦脊液墨汁染色，85.4%（41/48）的患者墨汁染色涂片查見新型隱球菌。53例患者分別進(jìn)行了腦脊液新型隱球菌抗原檢測和真菌培養(yǎng)，陽性率分別為100%（53/53）和88.7%（47/53）。見表1。

表1 54例艾滋病患者入院首次臨床檢測結(jié)果與預(yù)后的特征分析Table 1 Baseline laboratory tests and corresponding outcome of the 54 AIDS patients admitted to hospital

2.2.4 影像學(xué)檢查 44例進(jìn)行頭顱影像學(xué)檢查的患者中，25例表現(xiàn)為顱內(nèi)多發(fā)斑點(diǎn)狀、斑片狀、囊狀改變；8例表現(xiàn)為雙側(cè)基底節(jié)/額葉多發(fā)線狀、斑點(diǎn)狀改變；3例表現(xiàn)為右側(cè)額葉條片狀改變；4例表現(xiàn)為顱內(nèi)散在缺血灶，伴腦萎縮改變，4例頭顱影像學(xué)檢查未見異常。

表1 （續(xù)）Table 1（continued）

2.3 抗真菌藥物敏感試驗(yàn)

54株新型隱球菌中，1株（1.9%）對伏立康唑耐藥，1株（1.9%）對氟胞嘧啶耐藥，3株（5.6%）對伊曲康唑耐藥，54株均對氟康唑和兩性霉素B敏感。

2.4 MLST分型結(jié)果

54株新型隱球菌菌株共分為4個(gè)型，分別為VNⅠST5型46株，占85.2%；VNⅠST31型6株，占11.1%；VNⅠST79型1株，占1.9%；VNⅠST53型1株，占1.9%。上述5株耐藥菌株均為ST5型。

3 討論

新型隱球菌是一種被包裹的真菌，在周圍環(huán)境中普遍存在。近年來采用不同的分型方法，將全球各地的新型隱球菌分為8種主要的基因型，即VNⅠ～VNⅣ和VGⅠ～VGⅣ[9-10]。人 類 主要通過呼吸道感染新型隱球菌，其次為接觸和消化道感染[11]，新型隱球菌是真菌性腦膜炎的常見致病菌之一。對于HIV/艾滋病患者，新型隱球菌主要侵犯其中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起新型隱球菌性腦膜炎，此外亦可侵入骨骼、肌肉、淋巴結(jié)、皮膚黏膜引起慢性炎癥和膿腫。

本研究采集54例艾滋病患者的臨床病例中，男女比1∶0.3，男性遠(yuǎn)多于女性，這與廣東地區(qū)、臺灣地區(qū)及歐洲研究結(jié)果一致[5,12]；年齡為11～75歲，平均（45.0±14.5）歲，多數(shù)為漢族，已婚，家務(wù)及待業(yè)等人群特點(diǎn)，且77.8%患者平素體健，無基礎(chǔ)疾病，近30%患者經(jīng)治療后病情無好轉(zhuǎn)。54例患者首次送檢體液培養(yǎng)陽性的樣本類型最多的為腦脊液，占70.4%（38/54），這與新型隱球菌容易侵犯HIV/艾滋病患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。患者臨床表現(xiàn)以發(fā)熱為最多見，其次為頭痛、乏力、體重下降；影像學(xué)檢查顯示，大部分患者頭顱影像學(xué)表現(xiàn)為顱內(nèi)多發(fā)斑點(diǎn)狀、斑片狀、囊狀改變，與既往報(bào)道相似[13-14]，這提示新型隱球菌性腦膜炎臨床表現(xiàn)不典型，最常見的癥狀是頭痛、發(fā)熱、嘔吐、乏力等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，需要與其他細(xì)菌性腦膜炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相鑒別，早期對癥干預(yù)，減少死亡率。

實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示，59.3%患者首次實(shí)驗(yàn)室檢查白細(xì)胞檢測值處于正常參考值范圍內(nèi)，70.4%患者首次淋巴細(xì)胞檢測值低于參考值下限，而CD4+T淋巴細(xì)胞絕對值＜100/μL患者占92.6%，小于50/μL患者占79.6%；HIV-1病毒載量＞104拷貝/mL的患者占70.4%，雖然CD4+T淋巴細(xì)胞絕對值和HIV-1病毒載量與患者預(yù)后無顯著相關(guān)性，但較低的CD4+T淋巴細(xì)胞絕對值和較高的HIV-1病毒載量可能會增加艾滋病患者感染新型隱球菌的概率。通過腦脊液檢查發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)患者主要表現(xiàn)為“兩高兩低”的特征，即腦脊液壓力增高、總蛋白定量增高、腦脊液氯化物及葡萄糖定量降低，與其他細(xì)菌性腦膜炎相似，增加了臨床上與其他性質(zhì)的顱內(nèi)病變的鑒別難度。從本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果來看，腦脊液壓力增高與患者預(yù)后有顯著相關(guān)性（P＜ 0.05），而腦脊液氯化物、葡萄糖定量、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與患者預(yù)后無密切關(guān)系（P均＞ 0.05）。有研究顯示，艾滋病合并新型隱球菌感染的住院患者中約90%有顱內(nèi)壓增高的癥狀，近80%院內(nèi)死亡病例有顱內(nèi)壓升高的表現(xiàn)[14]，與本研究中住院患者、預(yù)后不良患者的顱內(nèi)壓增高分別占88.7%（47/53）、73.3%（11/15）一致。

本研究納入的艾滋病患者均有明確的新型隱球菌性腦膜炎病原學(xué)和/或免疫學(xué)證據(jù)（培養(yǎng)、腦脊液墨汁染色和新型隱球菌抗原檢測三種方法任意一種為陽性[13]），但這些新型隱球菌性腦膜炎患者入院首次培養(yǎng)陽性的樣本除了腦脊液以外，有9例患者血液培養(yǎng)在時(shí)間上優(yōu)先于腦脊液報(bào)陽，有6例患者血液培養(yǎng)陽性而腦脊液培養(yǎng)陰性。本研究對54例患者的腦脊液墨汁染色診片和新型隱球菌抗原檢測進(jìn)行了對比分析：48例患者進(jìn)行了腦脊液墨汁染色，41例患者查見新型隱球菌；53例進(jìn)行新型隱球菌抗原檢測患者中，陽性率100%。以腦脊液培養(yǎng)方法為金標(biāo)準(zhǔn)，腦脊液墨汁染色涂片和新型隱球菌抗原檢測兩種方法的靈敏度、一致性 分 別是85.4%（41/48）、87.5%（42/48）和100%（47/47）、100%（47/47）。目前臨床上確診新型隱球菌腦膜炎感染，仍需要借助于真菌培養(yǎng)、腦脊液墨汁染色和新型隱球菌抗原檢測三種實(shí)驗(yàn)室方法，在缺乏病原學(xué)依據(jù)時(shí)鑒別診斷尤為困難。在重慶地區(qū)兩項(xiàng)回顧性研究中指出，新型隱球菌腦膜炎是艾滋病死亡中常見的機(jī)會感染疾病之一（排列第六位）[15]；艾滋病人群中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染總體發(fā)病率為11.27%，新型隱球菌性腦膜炎發(fā)病率為3.25%，僅次于結(jié)核性腦膜炎（4.50%），排列第二位[16]。因此，在經(jīng)濟(jì)較發(fā)達(dá)的地區(qū)，當(dāng)高度懷疑新型隱球菌性腦膜炎感染時(shí)，應(yīng)多次送檢不同類型樣本，聯(lián)合多種實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行檢測，以提高檢測陽性率。

兩性霉素B、氟胞嘧啶和氟康唑是目前艾滋病合并隱球菌性腦膜炎抗真菌治療的常用有效藥物。臨床上常采用兩性霉素B聯(lián)合氟胞嘧啶一期誘導(dǎo)治療后，再使用氟康唑和氟胞嘧啶聯(lián)合用藥進(jìn)行鞏固期維持治療。本研究中所有受試菌株均對氟康唑敏感，但以往有研究對全球近3 000株新型隱球菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，氟康唑耐藥率11.2%[14]，故其耐藥問題仍然不容忽視。本研究中，伊曲康唑耐藥率5.6%，其作為誘導(dǎo)期和鞏固期的替代藥物，較少用于治療隱球菌性腦膜炎。伏立康唑在臨床上的使用日漸增多，本研究54例患者中，有7例使用了伏立康唑聯(lián)合治療，體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示伏立康唑耐藥率較低（0.7%），亦有研究顯示伏立康唑?qū)?biāo)準(zhǔn)方案治療失敗的難治性隱球菌病，病情可得到有效控制[15]，提示伏立康唑?qū)χ委熾[球菌病具有潛在價(jià)值。

本研究借助于測序技術(shù)來揭示保守基因的等位基因突變來對病原菌進(jìn)行分型和鑒定，通過對每個(gè)菌株MLST的比較可以揭示各個(gè)分離株之間的親緣關(guān)系。54株新型隱球菌菌株經(jīng)鑒定：基因型均為VNⅠ型，85.2%的菌株為ST5家族，11.1%的菌株為ST31型。與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的我國廣東、華北、華東、香港、臺灣地區(qū)以及日本、韓國的主要型別相同[17-20]。本研究也提示ST5家族是重慶市艾滋病患者感染的主要克隆系，除ST5家族以外的其他家族暫未發(fā)現(xiàn)耐藥株。

本研究受限于對同一患者用藥前后培養(yǎng)分離出不同菌株或同一患者不同體液標(biāo)本分離出的菌株缺乏藥物敏感性試驗(yàn)、MLST等比較分析，對服藥前后菌株耐藥譜是否發(fā)生改變，同一患者是否感染了不同基因型的菌株仍不清楚，需進(jìn)一步深入研究。