比較在肉湯及人工痰液培養基中多黏菌素E對鮑曼不動桿菌的殺菌效果

曲星伊，劉笑芬，卞星晨，陳淵成，張 菁

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）是醫院感染的重要致病菌之一[1-2]，2018年CHINET數據顯示其對常見碳青霉烯類抗生素耐藥率已超過70%[3]。鮑曼不動桿菌幾乎存在于所有環境中[4]，由于具有對干燥和潮濕環境的抵抗力、對消毒劑和抗生素的耐受性以及在醫療器械表面定植并形成生物膜的特性[5-9]，因而能在醫療機構中穩定存在并傳播。Rodman等[10]發現胸腔液誘導鮑曼不動桿菌丙酮酸和苯丙氨酸代謝增強，會影響上皮細胞生存并增強鮑曼不動桿菌對巨噬細胞的毒性，產生細胞毒性和免疫逃逸現象。Di Venanzio等[11]采用體外尿液培養鮑曼不動桿菌時，低毒力菌株生長量和生長速率均低于高毒力菌株，但是在營養豐富的LB培養基和腦心浸液肉湯培養基（brain heart infusion，BHI）中，不同毒力菌株的生長曲線差異不大。因此，模擬真實的人體環境有利于更好地認識細菌對人體的作用，使臨床前體外實驗更接近于臨床實際，但目前相關研究較少。

藥動學/藥效學（PK/PD）數學模型是利用計算機模擬技術描述藥物對細菌殺菌作用的方法。通過建立數學模型描述細菌的生長情況、藥物濃度變化獲得擬合參數，可用于評價藥物殺菌作用[12]，為臨床抗菌藥物給藥方案設計提供依據[13]。

由于現有抗菌藥物難以滿足細菌不斷進化出的新型耐藥機制[14]，多黏菌素類抗生素不得不被重新使用并成為了治療鮑曼不動桿菌感染的最后一道防線[15-16]。本研究以模擬人體痰液的培養基代替常用的陽離子調節MH肉湯（CAMHB），探索不同培養基中多黏菌素E對碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）的殺菌效果，并基于時間殺菌曲線建模和模擬，以定量方法進一步評價多黏菌素E的殺菌作用，為今后實驗研究和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌菌株 共選用3株細菌：2株CRAB菌株分別分離自華山醫院感染患者（菌株編號AB170428）和多中心臨床研究受試者（菌株編號AB070311），1株質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.1.2 抗菌藥物 抗菌藥物選用多黏菌素E硫酸鹽（批號SLBD8306V，效價78.6%，Sigma-Aldrich公司）、美羅培南（批號130506-201403，效價87%，中國食品藥品檢定研究院標準品）和多立培南（批號0379，效價99.8%，鹽野義制藥株式會社）。

1.1.3 培養基 本實驗使用CAMHB（Becton Dickinson公司）和人工痰液培養基（ASM，自行配制，配制方法詳見1.2.2）。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥敏試驗 采用肉湯微量稀釋法測定多黏菌素E、美羅培南、多立培南對CRAB的最低抑菌濃度（MIC），大腸埃希菌ATCC 25922為質控菌株。多黏菌素E的濃度范圍為0.125～16 mg/L，美羅培南和多立培南的濃度范圍為0.25～256 mg/L。藥敏試驗判斷標準參照美國臨床與實驗室標準化協會（CLSI）2019年版標準：多黏菌素E，MIC≤2 mg/L判定為敏感，MIC≥4 mg/L判定為耐藥；美羅培南和多立培南，MIC≤2 mg/L判定為敏感，MIC 4 mg/L判定為中介，MIC≥8 mg/L判定為耐藥。

1.2.2 ASM的配制 使用無菌蒸餾水做溶劑，配制每升體積中包含魚精DNA（4 g）、豬胃Ⅱ型黏蛋白（5 g）、蛋黃乳液（5 mL）、20種L型必需和非必需氨基酸（每種0.25 g）、KOH（0.7014 g）、DTPA（5.9 mg）、NaCl（5 g）、KCl（2.2 g）的培養基，調節pH至6.9，0.22 μm除菌過濾器（Merck公司）負壓過濾除菌[17]。現配即用。

1.2.3 靜態殺菌曲線 將鮑曼不動桿菌分別在10 mL新鮮配制的CAMHB和ASM中培養。在INNOVA 4200 搖床中37℃ 150 r/min條件下預培養1 h后進行菌落計數并記為時間0點，加入不同濃度的多黏菌素E后繼續在搖床中培養。在0、1、2、4、6、8、24 h分別進行菌落計數。在CAMHB和ASM中培養的鮑曼不動桿菌分別在20～24 h和40～48 h后記錄細菌菌落數。檢測下限為2 lgCFU/mL。每組實驗重復3次。以每毫升菌落形成單位的對數值隨時間變化作殺菌曲線，計算24 h與0 h菌落數的對數差，若對數差≥3 lgCFU/mL則認為有完全殺菌作用[18]。

1.2.4 建立PK/PD模型并預測殺菌效果

1.2.4.1 CAMHB中的數學模型 ①生長模型 在CAMHB中的細菌增長用微分方程描述：

其中Bt代表細菌密度，是時間t的函數；Bmax代表最大細菌密度。knet是細菌的凈生長速率常數。

②多黏菌素E的PD模型Emax模型是一種常用的非線性劑量反應模型。在經典的SigmoidEmax模型基礎上引入適應性耐藥因子α。經若干次尋優后確定的模型方程為：

其中

Ec代表多黏菌素E的殺菌速率，Emax_c為多黏菌素E的最大殺菌速率常數，EC50_c為達到1/2Emax_c時多黏菌素E的濃度。Cc為多黏菌素E的濃度，在24 h范圍內恒定。γc為多黏菌素E的希爾系數。α為適應性耐藥因子，隨藥物作用時間t的延長和濃度Cc的增加而逐漸增加最終接近飽和值。f為最大適應因子，k為適應性耐藥率，與基線耐藥率k0和藥物濃度Cc有關，常數ε為藥物濃度Cc的指數。

1.2.4.2 ASM中的數學模型

①生長模型 實驗中觀察到與CAMHB相比，ASM中細菌數目增長存在延遲。因此模型中引入延遲作用因子：

knet'和Bmax'分別代表細菌在ASM中的凈生長速率常數和最大細菌密度，μ1為生長滯后效應因子，由于營養物質的限制等因素導致的生長延遲用（1-e-μ1t）進行校正。

②多黏菌素E的PD模型Ec_lag代表ASM中多黏菌素E的延遲殺菌速率，Ec是多黏菌素E在CAMHB中的殺菌速率，（1-e-μ2t）為藥物效應延遲校正函數，μ2代表藥物滯后效應因子。

1.2.4.3 模型建立與預測 使用MATLAB （R2019a）擬合殺菌曲線、預測藥物效應以及繪制圖像。用函數ODE45積分，interp1線性差值做近似，利用lsqnonlin函數使殘差平方和最小的原理做非線性最小二乘法求得參數。通過目測檢查、比較殘差平方和大小以及相關參數是否符合實際情況，綜合確定最優參數值。通過繪制實測值與擬合值組合圖，判斷擬合效果。

利用模型預測鮑曼不動桿菌菌株在恒定抗生素濃度時的菌落數隨時間變化的曲線。多黏菌素E的最高暴露量為平均穩態血藥濃度2 mg/L，更高的濃度將增加急性腎損傷的風險[19]，因此模擬多黏菌素E最高濃度選擇2 mg/L。

2 結果

2.1 藥敏試驗

AB170428和AB070311菌株對多黏菌素E均敏感，MIC分別為0.5 mg/L和1 mg/L；對美羅培南均耐藥，MIC分別為16 mg/L和64 mg/L；對多立培南均耐藥，MIC分別為32 mg/L和64 mg/L。

2.2 靜態殺菌曲線

在CAMHB和ASM中，不同濃度多黏菌素E的殺菌曲線見圖1。在CAMHB中，隨著多黏菌素E濃度的遞增，殺菌效果增強。0.25 mg/L（即0.5×MIC）的多黏菌素E作用于AB170428后，0～8 h抑菌效果較好，24 h菌落數與0 h持 平；0.5 mg/L（即1×MIC）的多黏菌素E對AB170428具有24 h持續抑菌作用。0.25～1 mg/L（即0.25～1×MIC）的多黏菌素E對菌株AB070311的殺菌效果差別較小，0～8 h時多黏菌素E具有較好的抑菌效果，24 h鮑曼不動桿菌菌落數相較于0 h增加了約3 lgCFU/mL。在ASM中，即使經過了1 h的預培養，沒有抗生素作用的細菌仍然增長十分緩慢，在8～10 h到達穩態；1×MIC的多黏菌素E對鮑曼不動桿菌的殺菌效果與CAMHB相當；AB170428的24 h菌落數與0 h接近，AB070311的24 h菌落數相較于0 h下降1 lgCFU/mL。

2.3 PD數學模型擬合及預測

以AB170428菌株為例，在CAMHB中，生長曲線實驗數據點分布在擬合曲線上或平均分布在兩側（圖2）。多黏菌素E組的菌落數實驗數據不夠穩定，導致擬合值與實測值稍有偏差，可能與多黏菌素E的異質性耐藥性有關。在ASM中，生長滯后效應因子的引入使曲線擬合更貼切。AB070311擬合結果與AB170428類似。

圖1 在CAMHB和ASM中不同濃度多黏菌素E對鮑曼不動桿菌的殺菌曲線Figure 1 Time-kill curves of different concentrations of colistin against Acinetobacter baumannii in CAMHB and ASM

圖2 不同多黏菌素E濃度下AB170428在CAMHB和ASM中菌落數隨時間變化的擬合結果Figure 2 Fitting results from time-kill curves of Acinetobacter baumannii AB170428 in CAMHB and ASM

對比不同培養基中擬合的參數值，鮑曼不動桿菌在ASM中的凈生長速率常數（knet'）明顯高于CAMHB中的knet，由于凈生長速率常數knet和knet'是通過細菌生長曲線擬合的，排除了抗生素和培養基相互作用的影響因素，因此，擬合結果（表1）提示不同培養環境對細菌增殖有影響。模型擬合值與實測值組合圖中數據點基本分布在趨勢線的兩側 （圖3），R2分別為0.9653 （CAMHB）和0.9677（ASM）。

圖3 模型擬合值與實測值組合圖Figure 3 Diagnostic maps of model fitting value versus measured values

在CAMHB中，多黏菌素E對AB170428和AB070311都起到了一定的殺菌效果，但是1×MIC的多黏菌素E不足以完全抑制AB070311在24 h內的生長，模擬結果顯示2×MIC多黏菌素E可以持續抑制細菌生長。體外殺菌曲線實驗顯示多黏菌素E在ASM和CAMHB中對鮑曼不動桿菌的殺菌效果相當，但圖4模擬結果中多黏菌素E在ASM中的殺菌作用稍弱于CAMHB。

3 討論

本實驗首次使用ASM培養鮑曼不動桿菌進行PK/PD研究，評價不同培養基條件下多黏菌素E對鮑曼不動桿菌的殺菌效果，并建立PK/PD模型模擬不同濃度多黏菌素E的殺菌效果，為臨床前體外實驗提供了新的思路。

不同培養基對細菌增殖的影響不同，體外殺菌曲線實驗發現，鮑曼不動桿菌在ASM中培養后，在LB瓊脂平板上時而出現生長緩慢情況，35℃溫室培養24 h后平板上形成的菌落小，往往需要更長時間的培養（如40～48 h）才能進行菌落計數，此現象與金黃色葡萄球菌突變株長出小菌落、生長受限的現象一致[20]，推斷鮑曼不動桿菌可能通過調節基因的表達改變自身生長情況來適應環境，在ASM營養物質缺乏的環境中采取下調代謝和生長速率的策略。在ASM中培養鮑曼不動桿菌24 h出現菌落密度下降，可能由于細菌通過自主調節密度來減少營養物質消耗、節約養分，提高種群生存率[21]。

圖4 在CAMHB和ASM中不同多黏菌素E濃度作用下的菌落數隨時間變化預測結果Figure 4 Predicted time-kill curves under different colistin concentrations in CAMHB and ASM

對比CAMHB和ASM中的殺菌曲線可以看出，0～2 h內鮑曼不動桿菌在ASM中生長緩慢，且相同濃度的多黏菌素E在ASM中0～2 h的殺菌作用更弱。此現象與Greulich等[22]及Haugan等[23]的觀點一致，即更快的生長速率與抗生素的作用效果呈正相關。基于此，ASM中引入生長滯后效應因子和藥物作用滯后效應因子建立模型，更好地模擬了鮑曼不動桿菌生長及多黏菌素E殺菌的遲滯作用。

在ASM中，盡管早期鮑曼不動桿菌生長速率較低，但遲滯期后，鮑曼不動桿菌生長速率上升，ASM中生長速率常數高于CAMHB。模擬結果顯示，2 mg/L的多黏菌素E在ASM中殺菌效果較弱，與靜態殺菌曲線展示的兩種培養基中多黏菌素E作用效果相當的現象不同。結合實驗菌株在ASM中的凈生長速率值更大，猜測鮑曼不動桿菌更適應痰液環境，盡管初始存在生長延遲，但在適應環境后可能具有更大的增殖潛力。

盡管多黏菌素E在體外實驗中具有良好的穩定性[24]，且對CRAB具有較高的抗菌活性，但在殺菌曲線實驗中經常觀察到細菌再生的現象。本實驗也提示臨床上單獨使用多黏菌素E治療鮑曼不動桿菌感染時需要謹慎，要防止治療過程中細菌生長出現反跳，更推薦多黏菌素E聯合用藥治療鮑曼不動桿菌感染。

本實驗采用了靜態殺菌曲線的方法，即抗菌藥物的濃度保持恒定，沒有考慮到藥物在人體中的吸收、分布、代謝、排泄過程，可以進一步利用體外動態PK/PD模型，模擬不同人體環境和給藥方案下抗菌藥物對細菌的作用效果。