紅參中總皂苷及人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的測(cè)定

劉春霖，謝強(qiáng)勝，李啟艷，高天陽，劉慧香，蔣慧

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東省食品藥品安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101)

紅參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey. )的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖。具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，益氣攝血的功能[1]。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，紅參可以提高人體免疫力、抗疲勞、抗衰老、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)神經(jīng)、心血管及人體內(nèi)分泌系統(tǒng)等功效[2-7]。紅參中含有的成分很多，人參皂苷類成分是其主要藥理活性成分。紅參是將鮮參或生曬參經(jīng)高溫蒸制干燥而得，鮮參中的皂苷類成分會(huì)發(fā)生糖苷鍵和酯鍵的斷裂，生成某些特有皂苷[8]，主要體現(xiàn)在較大極性人參皂苷的脫糖基轉(zhuǎn)化以及人參皂苷C-17位側(cè)鏈的變化[9-11]。紅參中特有的皂苷組分所含糖鏈更少，極性更低，更有利于人體腸道吸收。因此，人參皂苷是衡量紅參質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)。

人參皂苷的主要分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、比色法(UV)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)等[12]。其中高效液相色譜法和比色法為常用的人參皂苷測(cè)定方法，高效液相色譜法適合單體人參皂苷含量的測(cè)定，比色法適合人參總皂苷含量的測(cè)定[13]。因此，本文以皂苷類成分為測(cè)定指標(biāo)，采用紫外可見分光光度法、高效液相色譜法，分別對(duì)紅參中總皂苷及人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler Toledo Ms十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；TU-1901紫外分光光度計(jì)(北京普析通用公司)；島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)。

1.2 試劑試藥 甲醇、乙腈，色譜純；磷酸、正丁醇、三氯甲烷、乙醇、高氯酸、冰乙酸，分析純；水為超純水；5%香草醛溶液：稱取5 g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100 mL。

對(duì)照品：人參皂苷Re(含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110754-201626，純度97.4%)；人參皂苷Rg1(含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110703-201832，純度92.4%)；人參皂苷Rb1(含量測(cè)定用，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110704-201424，純度93.7%)。

紅參藥材：吉林省20批，遼寧省4批，黑龍江省2批，均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)田景振教授鑒定為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Mey.)的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅參中總皂苷含量的測(cè)定方法 精密稱取紅參樣品粉末適量(過四號(hào)篩，稱樣量根據(jù)總皂苷含量定)，置100 mL容量瓶中，加少量水，超聲15 min，再用水定容至100 mL，搖勻，放置，吸取上清液1.0 mL進(jìn)行柱層析。取層析柱，內(nèi)裝3 cm D-101大孔吸附樹脂，上加1 cm中性氧化鋁。先用25 mL 70%乙醇洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，精確加入1.0 mL上述已處理好的樣品溶液，用25 mL水洗柱，棄去洗脫液，再用25 mL 70%乙醇洗脫總皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置于60 ℃水浴揮干，以此作顯色用。在上述已揮干的蒸發(fā)皿中準(zhǔn)確加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，轉(zhuǎn)動(dòng)蒸發(fā)皿，使殘?jiān)芙猓偌尤?.8 mL高氯酸，混勻后移入10 mL帶塞刻度離心管中，60 ℃水浴上加熱10 min，取出，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后，以1 cm比色皿于560 nm波長處與標(biāo)準(zhǔn)管一起進(jìn)行比色。

2.1.1 對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察 精確稱取人參皂苷Re對(duì)照品17.92 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即每1 mL含人參皂苷Re 1.745 mg。吸取上述人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液25、50、75、100、125 μL置蒸發(fā)皿中，于60 ℃水浴揮干，加水適量溶解殘?jiān)韵虏僮鲝摹爸鶎游觥逼穑c樣品相同，測(cè)定吸光度值。以濃度(μg)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.00428X-0.01892，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7。結(jié)果表明，人參皂苷Re在43.62～218.1 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)曲線第3點(diǎn)顯色后的溶液，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算平均吸光度為0.553，RSD為0.093%。結(jié)果表明，精密度良好。

2.1.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份樣品(編號(hào)：1)，每份約0.125 g，分別精密加入人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.745 mg·mL-1)1.5 mL，按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率為92.5%，RSD為2.6%。結(jié)果表明，回收率良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份樣品(編號(hào)：1)，每份約0.25 g。按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，測(cè)定吸光度，計(jì)算總皂苷平均含量為2.20%，RSD為2.0%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.1.5 檢出限 參照GB/T 5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法 理化部分 總則》中附錄A.2.2規(guī)定，檢出限為3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(測(cè)定次數(shù)n≥20)相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量，吸光法按國際理論與應(yīng)用化學(xué)家聯(lián)合(IUPAC)規(guī)定。檢出限按下式進(jìn)行計(jì)算：檢出限=Ks/b；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的斜率；s—20次空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；K—一般為3。計(jì)算檢出限為2.4 μg。

2.1.6 樣品測(cè)定 按上述試驗(yàn)方法，對(duì)26批不同產(chǎn)地的紅參樣品中總皂苷含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，總皂苷含量為1.2%～3.0%，說明不同產(chǎn)地紅參的總皂苷含量存在差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。具體結(jié)果見表1。

表1 紅參藥材總皂苷測(cè)定結(jié)果

方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，紫外可見分光光度法測(cè)定紅參中總皂苷的方法精密度好，重現(xiàn)性高，方法專屬性強(qiáng)。

2.2 紅參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量的測(cè)定 方法：取紅參樣品粉末(過四號(hào)篩)約l g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加熱回流3 h，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入100 mL錐形瓶中，精密加水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長：203 nm；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫。

表2 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液制備及線性關(guān)系考察 取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1、Re、Rb1各1 000 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.4、1、2、5、10 mL加甲醇定容到10 mL，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得。按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別是：人參皂苷Rg1為Y=3 945.08X+1 099.92，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；人參皂苷Re為Y=3 312.86X-1 659.22，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9；人參皂苷Rb1為Y=2 753.65X+3 564.87，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明，人參皂苷Rg1在8.574 7～857.47 μg·mL-1，人參皂苷Re在10.393～1 039.3 μg·mL-1，人參皂苷Rb1在9.754 2～975.42 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取每1 mL含人參皂苷Rg1、Re、Rb1各0.2 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算平均峰面積，分別是人參皂苷Rg1為645 177，RSD為0.53%；人參皂苷Re為652 791，RSD為0.61%；人參皂苷Rb1為516 661，RSD為0.60%。結(jié)果表明，精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，計(jì)算平均峰面積，分別是人參皂苷Rg1為685 611，RSD為0.24%；人參皂苷Re為693 030，RSD為0.31%；人參皂苷Rb1為546 901，RSD為0.18%。結(jié)果表明，各組分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一編號(hào)紅參樣品9份，每份約0.5 g，低、中、高濃度水平各3份。分別精密加入人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品適量，按上述試驗(yàn)方法和色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率，分別是人參皂苷Rg1為101.3%，RSD為0.46%；人參皂苷Re為102.0%，RSD為1.3%；人參皂苷Rb1為98.9%，RSD為1.4%。結(jié)果表明，各組分回收率良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一編號(hào)紅參樣品6份，每份約1 g。按上述試驗(yàn)方法和色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量，分別是人參皂苷Rg1為0.314%，RSD為0.57%；人參皂苷Re為0.155%，RSD為0.48%；人參皂苷Rb1為0.501%，RSD為0.53%。結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

2.2.7 樣品測(cè)定 按上述試驗(yàn)方法，對(duì)26批不同產(chǎn)地的紅參樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，人參皂苷Rg1、Re總量在0.17%～0.61%，人參皂苷Rb1含量在0.21%～0.81%，說明不同產(chǎn)地紅參的3種人參皂苷含量存在差異，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。具體結(jié)果見表3。

表3 紅參藥材3種人參皂苷測(cè)定結(jié)果

方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，高效液相色譜法測(cè)定紅參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1方法精密度好，重現(xiàn)性高，方法專屬性強(qiáng)。

3 討論

3.1 《中國藥典》2015年版(一部)紅參規(guī)定，本品按干燥品計(jì)算，含人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的總和不得少于0.25%，人參皂苷Rb1不得少于0.20%。本文26批紅參藥材中有1批含量低于限值規(guī)定，合格率為96.2%。所測(cè)結(jié)果最大比值為3.9倍，顯示含量差異較大，這可能與紅參的產(chǎn)地、參齡、加工炮制等有關(guān)，需要進(jìn)一步加以研究。

3.2 GB/T 22538-2018《紅參分等質(zhì)量》規(guī)定，本品按干燥品計(jì)算，人參總皂苷≥2.00%。本文26批紅參藥材中有11批含量低于限值規(guī)定，合格率為57.7%。合格率較低的原因可能是不同產(chǎn)地的紅參藥材本身質(zhì)量存在差異；另外總皂苷沒有統(tǒng)一的國標(biāo)檢測(cè)方法，不同檢測(cè)方法也可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。GB/T 22538-2018《紅參分等質(zhì)量》非強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)，而《中國藥典》2015年版(一部)紅參未規(guī)定總皂苷指標(biāo)。建議對(duì)紅參中總皂苷指標(biāo)加以控制，能更加全面客觀地反應(yīng)紅參的內(nèi)在質(zhì)量。

3.3 本文26批紅參藥材中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量之和與總皂苷含量的比值為0.32～0.57，平均比值為0.45，結(jié)果顯示，這3種單體人參皂苷在紅參皂苷類成分中只占一部分。紅參中除了與鮮參、生曬參共有的皂苷成分(如人參皂苷Ro、Rc、Rd、Rf等)外，還含有一些特有皂苷成分(如人參皂苷Rh1、Rh2、Rg3、Rg5、Rg6等)，需要進(jìn)一步的研究。