軍團菌檢測方法研究進展*

夏蘭蘭，宿振國 綜述，王 濤△ 審校

1.濱州醫學院附屬醫院檢驗科，山東濱州 256600；2.濱州醫學院煙臺附屬醫院檢驗科，山東煙臺 264000

軍團菌是一類革蘭陰性菌，1976年在美國費城召開退伍軍人大會期間，暴發了一種不明原因的肺炎，稱軍團病，次年分離出該病的病原菌，故而得名軍團菌，由該菌引起的疾病稱軍團菌病。軍團菌專性需氧，廣泛存在于自然界，特別是水中，適宜生長溫度為25～37 ℃，但也可在高于或低于該溫度范圍的環境中生存，甚至可在限制生長的溫度如<20 ℃或>55 ℃條件下存活[1]。該菌為一種機會致病菌，可以氣溶膠形式存在于空氣中，當人體免疫功能低下時，由呼吸道侵入機體，到達肺泡或終末細支氣管部位生長及繁殖，從而導致軍團菌病。目前，已確認的軍團菌屬有58種，共70個血清型，能引起約28種人類疾病，其中對人致病的主要是嗜肺軍團菌[2]。軍團菌病在臨床上可分為肺炎型、肺外感染型及流感樣型。肺炎型又稱軍團菌肺炎，是軍團菌病的主要類型，該病起病急，發展快，病情重，救治不及時可導致死亡；肺外感染型是指感染從肺部播散，導致腦、腎、肝等多器官感染；流感樣型又稱龐蒂亞克熱，是一種自限性疾病[3]。因臨床上大多數軍團菌肺炎患者早期臨床癥狀為乏力、肌肉疼痛、頭痛，發熱伴寒戰、咳嗽，有少量黏痰，與其他病原體引起的非典型性肺炎相似，所以很難與其他病原體引起的肺炎相區別，從而造成病死率較高，甚至引起暴發流行[4]。因此，早期、快速、準確地檢測出軍團菌，對疾病的診斷、治療及降低病死率有重要意義。軍團菌用吉姆薩染色時菌體呈紅色，活體組織標本用鍍銀染色法染色后菌體呈黑褐色，但標本直接涂片鏡檢的意義不大，本文不做贅述。軍團菌檢測的方法較多，包括病原菌的分離鑒定、免疫學檢測方法、核酸檢測方法等，本文就這些方法進行簡要敘述。

1 病原菌的分離鑒定

1.1細菌培養法 細菌培養法是診斷軍團菌病的金標準，其特異度為100%，靈敏度為50%～80%[5]。軍團菌檢測標本可通過采集痰液、下呼吸道分泌物、支氣管灌洗液、胸腔積液、血液等來獲取，采集時注意避免氣溶膠形成。但軍團菌生長對營養要求苛刻，在普通培養基、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板上均不生長，常用活性炭-酵母浸出液瓊脂(BCYE)培養基培養，且生長速度緩慢，一般需3～5 d，長則需7～14 d，菌落呈圓形、凸起、灰白色，有光澤，某些菌型在紫外線照射下可發出熒光，在富含L-絡氨酸-苯丙氨酸瓊脂平板上產生棕色水溶性色素，活的不可培養軍團菌的存在及在培養基上過度生長的其他菌會影響培養法的檢測結果。細菌培養法對技術人員要求較高，且操作繁瑣，培養時間長，故不能快速得到結果，不利于軍團菌病的診治。隨著現代技術的創新，研究者已陸續研制出改良的細菌培養法，可提高培養成功率，如2011年朱兵清等[6]在 BCYE培養基中添加了可抑制環境水樣中雜菌的抗菌藥物，提高了嗜肺軍團菌的分離率。同時細菌培養法也有不可替代的優點，如發現新菌種等[7]。總之，當臨床懷疑患者為軍團菌病時，細菌培養法是不可或缺的一種檢測手段。

1.2質譜分析技術 細菌的傳統手工鑒定步驟為分離純化獲得待鑒定菌株，涂片及革蘭染色鏡檢，根據革蘭染色性質和菌株形態，輔以氧化酶、觸酶、動力、鞭毛染色、氧化發酵等試驗，對鑒定細菌進行初步分群或分科(屬)，再繼續應用最小數量的其他試驗，逐步縮小鑒定范圍，直至最終獲得鑒定結果。傳統手工鑒定法步驟繁瑣，周期長，且對操作人員技術要求高。近年來，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜檢測技術在臨床微生物檢驗中的應用越來越廣泛，使用質譜儀可以大大縮短細菌鑒定時間，并提高準確性，更有利于臨床抗菌藥物的使用，做到早診斷、早治療，提高患者的生存率。李曲文等[8]應用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對10株軍團菌進行菌株蛋白質質譜分析比對，鑒定出8株為嗜肺軍團菌，1株為米克戴德軍團菌，1株為茴香軍團菌，此方法簡便、快速、成本低，不足之處是需要進一步規范標本處理、質譜圖采集和分析等過程，同時需要不斷完善數據庫和分析軟件。

2 免疫學檢測方法

2.1尿抗原檢測 有研究通過動物實驗證實在感染軍團菌24 h后尿中可出現抗原[9]。軍團菌的外膜蛋白、脂多糖和多種蛋白酶可造成肺組織損傷，尿抗原檢測針對的靶標即為細菌脂多糖。自20世紀90年代中期引入尿抗原檢測后，其逐漸成為軍團菌病的主要診斷方法，占軍團菌診斷試驗的70%～80%，包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫分析，以及最近發展的酶免疫分析(EIA)等，但這些方法主要對嗜肺軍團菌血清(Lp)1型敏感[10]。由于軍團菌病患者的標本可用性較低，因此對不同類型菌株的尿抗原檢測評價仍然比較困難。2017年有研究通過比較Binax?EIA(軍團菌尿EIA)、BinaxNOW?(軍團菌抗原檢測)、Sofia?FIA(軍團菌熒光免疫分析)3種試劑盒的靈敏度，發現對于Lp1型，Sofia?FIA和Binax?EIA檢測限相似，BinaxNOW?低于其他兩種試劑盒，且與Lp1型相比，這3種試劑盒對Lp2～Lp15型的檢測水平均較低。由此可見，這3種試劑盒對不同嗜肺軍團菌血清型的檢測性能不同[11]。

作為現在軍團菌檢測主要方法之一，尿抗原檢測具有諸多優點，如抗原出現時間早，約88%的軍團菌病患者在發病1～3 d即可在尿中檢測到抗原，可以為早期診療提供依據；此方法操作簡單、快速，特異度高，易取得標本，且對患者沒有創傷。缺點是只對Lp1型敏感，對其他血清型的嗜肺軍團菌檢測價值不大[12]，且檢測試劑盒昂貴，不利于在臨床上推廣應用。

2.2血清學診斷 血清學檢測對可疑患者診斷有重要意義，因為某些可疑患者無肺部感染癥狀，或下呼吸道未產生足量分泌物，標本不易獲取。血清學診斷包括微量凝集試驗和ELISA。早在1996年，米亞英等[13]就結合此兩種方法診斷出國內首例佐丹軍團菌病。但是，微量凝集試驗主要以整個菌體作為診斷抗原，這就導致嚴重的非特異性凝集，導致該試驗的特異度較低。ELISA檢測患者血清中嗜肺軍團菌IgG總抗體，其結果判定更加客觀、準確。但是，目前市場上用于診斷嗜肺軍團菌的試劑盒是用嗜肺軍團菌全細胞蛋白為包衣抗原，往往在不同血清型或種屬間存在交叉反應。因此，目前，臨床上對于軍團菌肺炎的血清學診斷仍缺少一種快速、準確的方法。2015年有研究曾分離并純化出嗜肺軍團菌蛋白FLA、MOMP、MIP、IP和PILE，并將這5種純化蛋白作為包衣抗原檢測嗜肺軍團菌血清抗體，其IgG抗體的靈敏度為90.4%,特異度為97.4%；IgM抗體的靈敏度為91.8%，特異度為95.1%[14]。王濤等[15]也成功誘導表達及純化出重組MOMP蛋白，將其作為診斷抗原建立了間接ELISA，結果顯示IgG抗體靈敏度為90.9%，特異度為91.7%，IgM抗體靈敏度為91.4%，特異度為90.6%，IgA抗體靈敏度為92.1%，特異度為88.9%，這為軍團菌病血清學診斷試劑盒的研制奠定了基礎。但是，不同軍團菌屬細菌之間、軍團菌與其他細菌之間有交叉抗原，軍團菌多克隆抗體與某些細菌可產生交叉反應，故血清學檢測只能作為輔助性、回顧性診斷手段。

3 核酸檢測方法

3.1聚合酶鏈反應(PCR)及其衍生技術 PCR是一種由 DNA 聚合酶催化的特定序列體外擴增技術，突破了核酸的原料限制，可將極微量的生物標本中靶核酸在短時間內大量復制擴增至可檢測范圍，具有高效、操作簡單的特點，已成為生物學和醫學研究,乃至臨床疾病診斷不可或缺的工具。嗜肺軍團菌常用的檢測模板為16S rRNA、5S rRNA、23S-5S rRNA、mip或dotA[16]，PCR擴增后，不僅可鑒定軍團菌，還可以分辨軍團菌屬。雖然PCR特異度高，但靈敏度較差，特別是對于痰液標本，由于含菌量較少，易出現假陰性結果。另外，常規PCR在產物分析時需要開蓋操作，容易引起交叉感染，導致假陽性。為更快、更好地檢測軍團菌，學者們已研究出一系列以PCR為基礎的相關技術。

3.1.1實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[17]。 GINEVRA等[18]利用全基因組測序數據，開發并驗證了一種靈敏度、特異度較高的實時熒光定量PCR方法，即通過擴增lpp1868基因檢測ST1克隆復合物中的Lp1，結果顯示靈敏度為95%，特異度為100%。這種新的PCR檢測方法是一種可靠的工具，將有助于改進軍團菌的檢測和鑒別，為軍團菌病的預防和控制進一步奠定了基礎。

3.1.2巢式PCR 巢式PCR需對靶DNA進行兩次擴增，第二次擴增所用的模板為第一次擴增的產物。巢式PCR通常設計兩對引物，第二對引物(第二次擴增所用引物)在靶序列上的位置應設計在第一對引物的內側。由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性(因為與兩套引物都互補的引物很少)，增加了檢測的靈敏度；有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。

嗜肺軍團菌可生活在水域系統中，WEN-CHIEN等[19]利用巢式PCR結合變性梯度凝膠電泳來檢測河水標本中的軍團菌群落，發現每種軍團菌都有自己的條帶模式，從而發現軍團菌群落的多樣性。同時，這種方法還可能發現環境中存在的未知軍團菌，甚至其他病原體。

3.1.3多重PCR 常用的PCR僅應用一對引物，通過擴增后產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子檢測。多重PCR又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加入多對引物，同時擴增一份DNA樣品中同一靶DNA或不同靶DNA的多個不同序列片段。臨床上常用于病原體分型或鑒定。2014年吳冬雪等[20]建立了一種多重PCR技術結合基因芯片的檢測方法，成功研制了嗜肺軍團菌O血清型分型基因芯片，實現了嗜肺軍團菌15種血清型的快速、準確檢測，使軍團菌的診斷又邁出了一大步，并提供了新的思路與方向。

3.2環介導等溫擴增技術(LAMP) LAMP是NOTOMI等[21]于2000年開發的一種在等溫條件下對DNA進行高特異度、高效率、快速擴增的檢測方法，即利用1種DNA聚合酶和4種特殊設計的引物在等溫條件(63 ℃左右)下保溫30～60 min，完成核酸擴增反應。LAMP作為一種全新的核酸擴增方法，與常規PCR相比，具有簡單、快速、特異度高的特點。目前，許多病原體都可通過LAMP進行快速檢測，如沙眼衣原體[22]。

LAMP的創新又為檢測軍團菌提供了新思路，如MOOSAVIAN等[23]就曾采用培養法、PCR和LAMP對2016年6月至2017年3月在伊朗阿瓦茲教學醫院住院的肺炎患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液標本進行軍團菌檢測，結果表明，培養法陽性率為1%，PCR和LAMP檢測軍團菌陽性率分別為3%和7%，由此可以得出，LAMP檢測軍團菌優于培養法和PCR。

4 其 他

軍團菌主要污染供水系統、空調冷卻水、呼吸機等，也可形成帶菌氣溶膠，通過空氣傳播，一旦暴發流行將嚴重危害人們的健康。2016年范曉姍等[24]將軍團菌的16S rRNA基因作為基因芯片，創立基因芯片檢測技術，對空調冷卻系統等公共衛生環境中的軍團菌進行實時監控，取得一定成果。但是，此方法成本過高，不利于推廣。因為臨床上軍團菌肺炎與其他肺炎癥狀相似，不易區分，MIYASHITA等[25]根據“男性、無咳嗽、呼吸困難、C反應蛋白和乳酸脫氫酶升高及低鈉”等條件，制訂出了一種新的軍團菌評分標準來區分軍團菌肺炎和非軍團菌肺炎，如果得分≥3分，則診斷為軍團菌肺炎，此方法的靈敏度為93%，特異度為75%，也可作為軍團菌的一種評估方法。

目前，軍團菌病在國內外時有暴發流行，在美國和歐洲國家的發病率也一直在增加[26]，且感染存在地區及季節差異，是影響公眾健康的一大隱患。因此，準確高效地檢測軍團菌，對軍團菌病的防控具有重要意義。隨著科技和知識的發展，用于檢測軍團菌的方法越來越多，筆者相信會有更簡便、快速、準確的檢測方法出現，為軍團菌的檢測提供更有力的保障，為人們的健康增添一重防護。