熒光探針在自噬檢測中的應用

袁媛 徐翠萍 張吉甜

(山東第一醫科大學附屬省立醫院，山東 濟南 250000 1 臨床營養科； 2 肺功能室)

自噬(autophagy)是細胞中一種進化保守的生命現象,其主要作用是清除和降解自身受損的細胞器以及多余的生物大分子,并利用降解產物提供能量和重建細胞結構,對維持細胞穩態和生命活動有重要意義[1]。自噬根據底物進入溶酶體的途徑不同一般分為3類：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。巨自噬發生時，在內質網或高爾基體周圍形成一個小的類似“脂質體”樣的雙層膜碗口狀結構，被稱為phagophore。當phagophore不斷延伸，將胞漿中衰老的細胞器、折疊錯誤的蛋白等全部攬入“碗”中，然后“收口”，從而成為密閉球狀的autophagosome，即“自噬體”。然后，自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，即自噬溶酶體，期間自噬體的內膜被溶酶體酶降解，自噬體中的“貨物”也被降解，產物(氨基酸、脂肪酸等)被輸送到胞漿中，供細胞重新利用，而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中[2]。自噬參與調節許多生理過程，包括營養素剝奪、圍著床期胚胎發育、能量缺失、氧化應激等，并參與多種疾病如糖尿病、糖尿病腎病、阿爾茨海默癥、骨性關節炎及多種腫瘤性疾病的發生發展過程[3-5]。

自噬的靜態檢測方法眾多，包括利用電子透射顯微鏡直接觀察不同階段的自噬結構，或基于免疫印跡實驗檢測自噬相關蛋白的表達，缺點是自噬具有多態、多步驟、動態的特點，某一時間點的自噬檢測不足以客觀反映自噬活性。現階段通常以自噬通量作為自噬水平的度量標準，包括底物從被自噬體包裹到運至溶酶體降解的全過程。自噬通量的檢測中，熒光探針具備可視化、可定量、染色簡便、細胞毒性低、設計靈活等特點，應用極為廣泛[6]。在此，本文總結了當前常用及新型探針的設計原理、優點及不足、應用范圍等，以便在自噬研究中合理應用。

1 微管相關蛋白輕鏈3(LC3)標記熒光探針檢測自噬通量

LC3是自噬檢測的一個熱門靶點，其泛素化樣結合于自噬體的雙層膜結構，是定位于自噬體的獨特修飾物。LC3由proLC3合成，proLC3的羧基末端被半胱氨酸蛋白酶切割，以暴露其羧基末端甘氨酸殘基Gly，形成LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ經過剪切和泛素化修飾過程，與自噬體雙層膜結構的磷脂酰乙醇胺和(或)磷脂酰絲氨酸(PE)結合形成LC3-磷脂綴合物(LC3-Ⅱ)，定位于自噬體[7-9]。隨著自噬體與溶酶體融合，自噬體胞質面上的LC3-Ⅱ被Atg4B脫脂形成LC3-Ⅰ，進入再循環，而自噬體腔表面上的LC3-Ⅱ被溶酶體水解酶降解。因此，LC3是一種很有前景的自噬體標記物，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉換及LC3-Ⅱ的降解，可區分自噬體數量和降解活性，并確定自噬過程是否已到達降解步驟[10]。

1.1 單熒光標記蛋白(FP)-LC3s

一般情況下，FP-LC3s，例如GFP-LC3、EGFP-LC3、YFP-LC3、CFP-LC3、RFP-LC3、mCherry-LC3和HcRed-LC3等，彌散分布在細胞質內，自噬被誘導時，FP-LC3被脂化并定位于自噬體和自噬溶酶體，形成熒光斑點，但利用熒光顯微鏡技術計量熒光斑點和強度并不能反映自噬通量的大小。因為斑點的聚集既可能是自噬被誘導，也可能是下游通路如自噬體和溶酶體融合障礙，或者是溶酶體內酶降解缺陷所致。因此，FP-LC3s在應用時一般需要加溶酶體抑制劑作為對照，溶酶體降解的抑制可以導致FP-LC3斑點進一步增加，表示自噬通量增加。此外，C端甘氨酸突變的LC3ΔG，因為不能被Atg4切割，不能轉化為LC3-Ⅱ，也可作為陰性對照。

利用熒光顯微鏡通過觀察FP-LC3檢測自噬的局限性主要為，生理性自噬時FP-LC3也會形成少量的熒光斑點，難以和誘導性自噬相區分；另外，在FP-LC3質粒轉染過程中若過表達，自身容易發生聚集，使自噬通量被高估。此時，可以設立C端甘氨酸突變的FP-LC3ΔG對照，因其不能被Atg4切割，不能轉化為LC3-Ⅱ，可作為陰性對照組。另外，自噬誘導劑如巴非霉素A1、氯喹或蛋白酶抑制劑可能引起附加效應，比如中和或抑制溶酶體酶可抑制mTOR，誘導自噬[11-12]；氯喹可以促進除自噬誘導外的LC3-Ⅱ形成[13]，并且氯喹、秋水仙堿和亮蛋白等溶酶體抑制劑對不同組織(器官)的作用似乎不同，精確檢測LC3-Ⅱ需要合理選擇溶酶體抑制劑作為對照[14]。

應用流式細胞術檢測FP-LC3熒光蛋白的強度分析自噬通量時，一般應用皂素使細胞破膜，使水溶性LC3-Ⅰ洗脫，定位于自噬體膜的脂溶性LC3-Ⅱ則仍保留在細胞內。此時聯用自噬抑制劑并應用流式細胞術進行分析，即可區分FP-LC3-Ⅱ熒光強度的增加是自噬通量增強還是自噬下游抑制所致。

另外，還可以應用Western-blot實驗對熒光蛋白抗體進行檢測。如GFP-LC3-Ⅱ進入溶酶體以后，LC3-Ⅱ會被酶解，GFP則被保留。應用GFP抗體可以檢測到GFP-LC3-Ⅰ、GFP-LC3-Ⅱ及GFP 3條免疫印跡。其中，游離GFP條帶表示自噬通量活化。同時，也應當使用自噬抑制劑作為對照，可避免GFP被自噬過度活化水解出現假陰性。

1.2 雙熒光串聯探針(Tf)-LC3

在FP-LC3應用中發現，EGFP-LC3發出的綠色熒光在溶酶體酸性條件下發生熒光衰減或猝滅，mRFP-LC3發射的紅色熒光在自噬溶酶體酸性環境中相對穩定。這種差異是由EGFP-LC3和mRFP-LC3的解離常數pKa(EGFP的pKa 5.9，mRFP的pKa 4.5)決定的[15]。pKa越高，在溶酶體等酸性囊泡中越容易發生熒光猝滅。由此，一種新型單分子雙熒光串聯蛋白標記的mRFP-EGFP-LC3探針開始用于監測自噬體成熟過程[15]。mCherry-EGFP-LC3、mKate2-EGFP-LC3熒光探針均屬于此類Tf-LC3探針[16]。一般情況下，Tf-LC3的綠色和紅色雙陽性熒光呈黃色彌散分布在細胞質(pH 7.4)中，自噬誘導時，Tf-LC3分別定位于自噬體和自噬溶酶體(pH 4～5)，呈現黃色熒光斑點和紅色熒光斑點。自噬誘導時，黃色熒光斑點和紅色熒光斑點數目均增加，當自噬體與溶酶體融合被抑制時，導致黃色熒光斑點增加，紅色熒光斑點降低。因此，可以通過計算紅色和黃色熒光斑點的比例判斷自噬通量的強弱。

在自噬研究中，Tf-LC3探針主要用來示蹤自噬體的成熟過程，可以通過激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術和活細胞工作站進行檢測。

當使用Tf-LC3探針檢測自噬時，綠色熒光蛋白有較高的pH敏感性，在溶酶體內完全猝滅，是靈敏區分自噬體和自噬溶酶體、監測自噬體成熟步驟的關鍵[17]。基于此原理，pHlurorin-mKate2-LC3以及mTagRFP-mWasabi-LC3探針應運而生，其中pHlurorin(pKa 7.6)pH敏感度高于mWasabi(pKa 6.5)和EGFP(pKa 5.9)[17-19]，在溶酶體內猝滅更完全，檢測自噬的靈敏度更高。

Tf-LC3探針的局限性體現在，當其轉移至溶酶體時，雖然RFP比GFP更穩定，但是最終仍然會被降解[20]。故選擇pH更加穩定的紅色熒光蛋白，如mKate2、mCherry可以相對提高結果的準確性。此外，與RFP串聯，GFP信號強度會因熒光再吸收或熒光共振能量轉移而降低，同時自噬誘導改變了RFP隨LC3在細胞內的分布，也會影響用熒光顯微鏡進行比率分析的精確度。因此，Tf-LC3探針更適宜于檢測個體自噬結構的成熟過程。進一步聯合紅外標記的溶酶體探針則可以進一步研究自噬小體、自噬溶酶體、溶酶體三者的動態變化。

1.3 雙熒光內對照探針GFP-LC3-RFP-LC3ΔG

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG雙熒光內對照探針可以將GFP-LC3融合到缺失C末端甘氨酸的RFP-LC3ΔG的N末端，可用于定量評估自噬通量。在胞質中，ATG4B在LC3的C末端甘氨酸后切割肽鍵[8]，將GFP-LC3-RFP-LC3ΔG分離為等摩爾量的GFP-LC3和RFP-LC3ΔG。GFP-LC3與PE綴合并定位于自噬體。與溶酶體融合后，自噬體內膜上的GFP-LC3被降解，外膜上的GFP-LC3被ATG4蛋白解耦聯并再循環回到胞質溶膠當中。RFP-LC3ΔG因C末端甘氨酸缺乏不能進行脂質化，故不參與自噬過程，穩定存在于細胞質中，作為內部對照。自噬通量的高低由GFP/RFP熒光信號比表示。GFP/RFP比值高，自噬活性弱；比值低，自噬活性強。

筆者前期的研究發現，GFP-LC3-RFP-LC3ΔG在小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、小鼠胰島β細胞(min6)、大鼠胰島素細胞(INS-1)、小鼠胰島β細胞瘤細胞(β-TC3)體外細胞實驗中均可穩定表達。作為單分子探針，在細胞質被切割成等摩爾量的GFP-LC3(自噬底物)和RFP-LC3ΔG(內部對照)，與Tf-LC3探針相比不改變RFP在細胞內的分布，避免了RFP在溶酶體酸性壞境下的微弱降解，精確度更高。此外，以RFP-LC3ΔG作為內部對照，相對于單熒光FP-LC3s，除不需要額外設立溶酶體抑制劑對照組外，還可以確定GFP強度的降低是因自噬增強，還是因LC3合成和(或)細胞數量的減少所致。因此，此探針非常適用于藥物高通量篩選，因為藥物本身毒性就會造成細胞的活力降低以及自身LC3合成減少而導致GFP熒光強度的降低。KAIZUKA等[21]應用此探針重新檢測了1 054種藥物，鑒定出13種新型誘導劑和18種新型抑制劑，并且此探針確定的43種抑制劑中有6種之前被定義為自噬誘導劑。另外，此探針不但可以進行體外細胞的自噬監測，還可以對活體生物體內基礎自噬進行監測，如監測斑馬魚受精卵著床期自噬活性；通過構建表達GFP-LC3-RFP-LC3ΔG的轉基因小鼠，可以用來監測生理狀態下不同器官以及組織的基礎自噬水平[22]。在此基礎上，2020年YAZAWA等[22]構建了更敏感的pHluorin-LC3-mCherry內對照探針，并且結合CRISPR/Cas9技術成功應用于小鼠全基因組gRNA篩選。綜上所述，新型內對照熒光探針GFP-LC3-RFP-LC3ΔG可應用免疫熒光顯微鏡、流式細胞儀、活細胞工作站等技術檢測自噬水平，適用于高通量篩選和測量體內基礎、病理狀態及藥物干預后的自噬水平。

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG探針整合到慢病毒基因組轉染細胞時，LC3和LC3ΔG容易發生同源重組，需通過克隆篩選避免無法降解的GFP-LC3ΔG出現[21]。所以單純定量監測自噬通量，可用GFP-LC3-RFP作為替代，不影響結果準確性，但無法示蹤細胞質LC3的翻譯后修飾過程[23-24]。此外，相比GFP-LC3在饑餓誘導自噬時30 min就能形成熒光斑點，此探針2～4 h才能觀察到明顯的GFP/RFP比率降低，時效性不足。另外，動物體內各種細胞、組織探針表達水平存在差異，導致比率變化可能會不一致。

2 溶酶體途徑相關熒光標記蛋白

2.1 雙激發峰熒光染料Keima

Keima是一種pH敏感、雙激發比率熒光蛋白，具有溶酶體蛋白酶的抗性。Keima在波長620 nm處具有發射峰，同時具有pH值依賴的雙激發峰。在細胞質中性pH條件下，Keima在波長440 nm位置具有激發峰，并且在溶酶體酸性區室中其激發峰移至波長550 nm位置。因此，可以通過在波長550 nm/440 nm處激發的信號強度比率計算隨時間從胞漿遞送至溶酶體的Keima的量。Keima應用時常與目標蛋白質或者細胞器靶向肽融合，以監測特定蛋白質或者細胞器的定位，多是用于評估選擇性自噬[25]。比如，將Keima融合到細胞色素C氧化酶Ⅲ序列當中后可構建線粒體靶向Keima的mt-mKeima[26-27]；把Keima定位在核糖體上，可研究核糖體自噬情況[28]。

微自噬可以直接將Keima從細胞質轉運到溶酶體并導致波長550 nm/440 nm處激發的信號強度比率增加[25]，而不經過自噬體形成階段。因此，要精確測量Keima的波長550 nm/440 nm處激發的信號強度比率的變化是否完全為自噬體-自噬溶酶體的途徑自噬，應當同時測定Keima和巨自噬標記蛋白，如LC3/p62。此外，Keima具有溶酶體酸性依賴性，因此不能用來測評固定后的細胞和組織。

2.2 酸性依賴熒光染料LysoTracker與DQ-BSA

LysoTracker在酸性環境下發出熒光[29]，可示蹤活細胞溶酶體。DQ-BSA是熒光蛋白酶底物衍生的牛血清白蛋白，被溶酶體、自噬溶酶體等酸性區室內的蛋白酶消化后釋放熒光[30]，可示蹤溶酶體和檢測溶酶體功能是否正常。AHSAN等[31]應用此探針驗證了番茄紅素可通過改善溶酶體功能促進自噬，從而發揮對缺血性神經元損傷的保護作用。兩者通常聯合LC3巨自噬標記物或其他選擇性自噬探針，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測自噬通量。

2.3 線粒體特異性雙激發/發射波長(ex/em)熒光染料HQO

線粒體自噬通常使用定位于線粒體和自噬體/溶酶體的熒光共定位方法評估。HQO是一種常用于評估線粒體自噬的花青色染料，毒性小，具有pH依賴的雙(ex/em)波長，其可以特異性地積聚在活細胞的線粒體內。在線粒體內，pH為中性情況下，ex/em波長為530 nm/650 nm時，呈綠色。當線粒體呈遞到溶酶體后，HQO被質子化為HQOH+，并且其ex/em波長移至710 nm/750 nm時，呈紅色。因此，HQOH+/HQO熒光發射比率可用于測定線粒體自噬通量的大小。而激光共聚焦顯微鏡可以通過熒光顏色變化示蹤線粒體自噬的過程。HQO可以選擇性聚集在線粒體內，且質子化前后斯托克位移大于100 nm，無需與其他探針分子聯用即可特異性地檢測線粒體自噬通量。但HQO和Keima一樣均具有pH依賴性，不可以用來測定固定后的細胞和組織。

2.4 陽離子雙親熒光染料Cyto-ID

Cyto-ID是一種陽離子雙親熒光示蹤染料，與LysoTracker或DQ-BSA相比，Cyto-ID可特異性標記自噬囊泡，而不對酸性溶酶體或自噬溶酶體區室染色，可以靈敏地區分巨自噬和微自噬，其與溶酶體抑制劑如BAF和CQ聯合使用，可以評估自噬通量[32]。Cyto-ID適用于熒光顯微鏡、流式細胞儀和分光光度計檢測技術，多用于RNAi篩選和小分子藥物高通量篩選，在開發自噬相關療法和監測自噬調節藥物效果方面具有較高的應用價值。

2.5 溶酶體極性依賴熒光染料Lyso-OC

溶酶體和自噬溶酶體具有不同的極性。雙光子熒光探針Lyso-OC由極性依賴性熒光香豆素和溶酶體靶向的嗎啉組成，可特異性標記活細胞溶酶體。Lyso-OC在波長760 nm處雙光子激發之下，在溶酶體中發射490～550 nm的亮綠色熒光。當溶酶體和自噬體融合后，具有極性依賴性的香豆素熒光淬滅為淺綠色。

Lyso-OC探針幾乎沒有細胞毒性，在MCF-7細胞、HeLa細胞、HELF細胞和CHO細胞等多種細胞系中顯示出良好的適用性，通過激光共聚焦成像可實時監測活細胞自噬過程，也可用流式細胞術做高通量篩選。但在使用過程中應排除其他細胞過程及溶酶體營養因子、自噬誘導劑和抑制劑對溶酶體極性的影響[33],且要區分微自噬和巨自噬，還應同時檢測其他自噬標記蛋白，如LC3/p62等。

總之，自噬參與調節多種生理和病理過程，為當前科研工作的熱點[3-5]。因其呈多步驟、動態性，自噬通量的準確檢測也是科研工作的難點。當前，以自噬標記性蛋白LC3和溶酶體依賴性探針為代表的熒光探針在自噬檢測中廣泛應用[6]。探針研發也從單熒光蛋白探針發展到雙熒光蛋白探針、含自身內對照的新型雙熒光蛋白探針以及特異性定位不同細胞器以檢測選擇性自噬的熒光探針；從體外實驗的熒光探針發展到通過轉基因技術在動物模型中表達以檢測在體自噬的探針。但每種探針均有其優點和不足。國內外自噬研究中均有因為沒有考慮到所使用探針的局限性使自噬檢測不夠精準，甚至因探針構建、選用等問題造成結果難以解釋或者謬誤。

因此在自噬研究中，不僅要根據各熒光探針的適用范圍和實驗目的進行合理選擇，往往還要根據實驗條件和目的在多個時間點和步驟，聯合應用多種檢驗和分析方法進行檢測，如利用電子顯微鏡檢測特定時間點自噬結構、利用免疫印跡檢測自噬相關蛋白LC3、P62的表達，同時應合理設置對照組以及聯用自噬誘導劑和抑制劑等，這樣才能更準確和更全面地反映細胞的自噬強度。