微小RNA與復發性流產研究進展*

涂許許，趙小萱 綜述，馮曉玲 審校

1.黑龍江中醫藥大學研究生院，黑龍江哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院婦科二科，黑龍江哈爾濱 150040

復發性流產(RSA)是指妊娠20周之前的自然流產在同一對配偶中出現2次或2次以上[1]，發病率約為5%，病因包括解剖學異常、染色體異常、內分泌異常、感染、環境污染、自身免疫機制等，但仍有40%～50%的RSA病因不明，被稱為不明原因的復發性流產(URSA)[2]。RSA嚴重影響患病女性的身心健康，使患者及其家庭對生育喪失信心，同時也增加了家庭的經濟負擔。

微小RNA(miRNA)是一種由22個左右核苷酸構成的非蛋白編碼短單鏈RNA，通過與靶向信使RNA(mRNA)的3′未翻譯區域(3′UTR)結合介導基因沉默[3]。miRNA的經典產生途徑中，細胞核中DNA被轉錄為初級miRNA(pri-miRNA)，RNase Ⅲ內切核酸酶Drosha對其切割和處理，并釋放60～100 nt的莖環中間體，稱為miRNA前體(pre-miRNA)。pre-miRNA還可通過非Drosha依賴的mirtron途徑產生。隨后Ran-GTP和輸出受體Exportin-5將pre-miRNA從細胞核主動轉運至細胞質。在細胞質中RNase Ⅲ內切核酸酶Dicer對pre-miRNA進行加工，使其成為miRNA雙鏈，包含了成熟miRNA(15～22 nt)。隨后鏈體解開，成熟miRNA通過Watson-Crick堿基配對機制與mRNA的3′UTR互補序列結合，組裝成RNA誘導沉默復合物，調控靶基因的表達[4]。它們在多種生物學過程中發揮作用，包括發育、分化、凋亡和癌變[5]。基于外周血、絨毛和蛻膜的研究已經發現，RSA患者miRNA表達存在顯著差異[6]，但對于miRNA參與RSA發生的可能機制仍處于探索階段，以下將對此做一綜述。

1 miRNA介導血管生成參與RSA的發生

在較為穩定的成年人血管網絡中，血管的新生是一個相對罕見的事件，但在特殊情況下，例如胚胎的著床和發育中，血管網絡可以擴張和重塑以適應不斷變化的條件，此過程被稱為血管生成，該過程包括3個階段：啟動、增殖-侵襲和成熟-分化[7]。子宮內膜血管生成及受其影響的蛻膜化是胚胎植入成功及成功妊娠的前提。血管生成與胎盤正常發育也有密切聯系，胎盤是母體與胎兒進行物質交換的重要場所，胎盤的血管生成有助于建立豐富的血液循環及促進其自身發育，使其更好地實現為胎兒提供營養及排出廢物的功能。大多數以流產為結局的妊娠被認為是由于母體螺旋動脈缺乏生理變化而導致胎盤缺陷引起的，胎盤血管發育缺陷及血管內皮功能受損可能導致RSA，血管生成水平受相關細胞因子調節，miRNA可通過影響血管生成相關因子導致RSA的發生[8]。

血管內皮生長因子(VEGF)是關鍵的血管生成啟動因子，來源于絨毛滋養層和絨毛間質巨噬細胞，在妊娠早期蛻膜細胞中高表達，促進血管發育和維持穩定。肖碧如等[9]發現，URSA患者絨毛中miR-29a水平與VEGF及微血管密度(MVD)呈負相關。還有一些研究也發現了RSA中miRNA與VEGF的關系，如URSA患者絨毛中高水平miR-200抑制VEGF，而低水平miR-155降低了血管新生因子sFlt-1的對抗，使血管生成狀態發生改變[10]；miR-150抑制VEGF表達[11]；RSA患者的miR-575水平與VEDF呈負相關[6]。

從妊娠早期開始，高度不成熟的血管內皮即使不斷膨脹也無法完全滿足不斷生長的胚胎/胎兒的氧氣和營養需要，導致胚胎發育在低氧環境中進行。缺氧誘導因子(HIF)對細胞氧濃度非常敏感，低氧濃度下積累的HIF-1蛋白與HIF-1二聚為有效的轉錄激活劑，與特定的DNA序列結合，在海綿狀滋養細胞的形成中起關鍵作用，調控胎盤的形成過程。miRNA對HIF有調控作用，URSA患者絨毛中miRNA-223-3p表達水平升高，而Rps6kb1mRNA、HIF-1αmRNA、VEGFmRNA表達水平及MVD均降低[12]。miRNA-223-3p可能通過抑制Rps6kb1/HIF-1α信號通路而使HIF-1α和VEGF表達水平下降，影響血管生成過程，導致絨毛及胎盤血管發育不良，無法供應胚胎及其附屬物的發育而導致流產。URSA女性絨毛中miR-210表達水平也被發現與HIF-1α、VEGF、MVD呈負相關[13]，提示miRNA作用于血管生成過程參與RSA的發生。

2 miRNA介導細胞凋亡、增殖參與RSA的發生

細胞凋亡是一種程序性調控的主動死亡過程，是妊娠期的正常生理過程，胎盤絨毛組織的細胞凋亡水平影響胎盤重塑，調節胎盤生長，而蛻膜化的內膜是母胎界面的重要組成部分，參與構成母體與胎兒物質交換的通道，絨毛和蛻膜的凋亡水平異常都可導致流產的發生，miRNA通過對多個信號通路的作用影響細胞凋亡水平，導致RSA的發生[14]。

p53是細胞凋亡和細胞周期的關鍵調控因子，p53基因編碼在DNA修復中起重要作用的53kd磷酸蛋白，p53可以感應DNA損傷并介導下游靶基因而實現調控功能，包括阻滯細胞周期、引起細胞衰老、誘導細胞凋亡、修復DNA等[15]。有研究發現，URSA女性絨毛組織中高表達的let-7f-5p可能通過調控p53信號通路中的MDM-X/MDM2/p53基因，促進細胞凋亡并參與URSA的發生[16]。ZHAO等[17]發現，URSA患者蛻膜中miRNA-365高表達，靶向細胞凋亡抑制因子SGK1下調MDM2及上調p53，造成G1期細胞周期停滯，并誘導細胞凋亡。miRNA也可通過其他通路調節細胞凋亡。

此外，miRNA調節DNA損傷反應(DDR)相關因子，從而影響細胞凋亡水平。DONG等[18]研究發現，RSA患者的絨毛中高表達的miR-520與多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)呈負相關。過表達miR-520的體外人滋養細胞中觀察到PARP1水平降低和以DNA損傷為特點的細胞凋亡，而PARP1過表達可恢復凋亡水平。PARP1被認為是DDR中的關鍵物質，DDR是一種復雜的信號轉導途徑，響應DNA損傷而被觸發，是保持基因組穩定的基礎。另一項研究指出，miR-520誘導滋養細胞凋亡的機制可能通過作用于內質網應激通路而實現[19]。

3 miRNA介導免疫耐受參與RSA的發生

妊娠是一種復雜的生理過程，胎兒攜帶父系基因及父系人類白細胞抗原(HLA)而不受到母體免疫系統的攻擊，是因為建立了良好的免疫耐受，RSA的發生與免疫異常相關[20]。

HLA-G是主要組織相容性復合物(MHC)Ⅰb類抗原，組織表達分布集中，幾乎僅在母胎界面處絨毛外滋養細胞中表達，其與自然殺傷細胞受體結合并傳遞抑制信號,從而使胎兒免受母體淋巴細胞的免疫性攻擊,這些現象反映了HLA-G可使胎兒免遭母體免疫系統的排斥[21]。WANG等[22]研究發現，正常核型RSA絨毛中miR-133a表達水平顯著升高，可能通過結合HLA-G 3′UTR阻斷翻譯過程，從而降低HLA-G水平。

母胎微環境中Th1/Th2平衡在正常妊娠中必不可少，ZHAO等[23]發現，URSA患者蛻膜中低水平miR-146a-5p通過TLR/白細胞介素(IL)-1R信號轉導途徑，產生過量的γ-干擾素(IFN-γ)，破壞Th1/Th2平衡，從而引發URSA。RSA患者miR-155表達水平降低，并與升高的TIM3(Th1的調節蛋白)、IL-4、IL-13及降低的IFN-γ水平具有相關性，提示miR-155可能作用于Th1/Th2平衡而參與RSA[24]。小鼠實驗證明了低水平miR-155將導致調節性T細胞(Treg)不足而造成反復的胎兒丟失[25]。

4 影響miRNA表達的因素

4.1表觀遺傳修飾影響miRNA的表達水平 表觀遺傳學包括一系列不涉及基因組改變且易受環境影響的可遺傳性進程，如DNA甲基化、非編碼RNA等。表觀遺傳學不僅影響細胞分化、發育等生理進程，也被證實參與許多疾病的發生發展過程[26]。

基因附近或內部胞嘧啶-磷酸-鳥苷酸(CpG)甲基化水平的改變可引起基因表達水平的改變，在miRNA基因的表達中也不例外[27]。馬天仲等[28]發現，URSA患者絨毛CpG甲基化位點與健康女性存在差異。DNA甲基化水平影響miR-133a-3p表達，RSA患者中高水平miR-133a可能通過抑制細胞增殖而導致RSA的發生。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過直接作用于miRNA影響其表達水平。崔進等[29]研究發現，RSA患者胚胎中lncRNA H19水平升高。H19在胎盤轉錄物中的水平位于第2，是第一批被發現的lncRNA之一。H19位點通過miR-675調節胰島素樣生長因子2(IGF2)及其受體胰島素樣生長因子受體(IGF1R)的水平，IGF1R與IGF2共同影響絨毛的增殖發育過程，參與流產的發生。此外，H19還可影響miRNA-675的靶蛋白NOMO1，從而影響滋養細胞增殖，影響妊娠進程。另一種lncRNA-miRNA的作用方式是“分子海綿”機制。“分子海綿”指lncRNA作為競爭性內源RNA(ceRNA)與miRNA結合，影響miRNA與編碼蛋白質的mRNA結合，使miRNA表達水平下降。RSA患者中miR-34a表達水平升高而lncRNASNHG7呈現低水平，lncRNASNHG7 可與miR-34a結合，從而降低miR-34a對滋養細胞增殖和侵襲的抑制作用[30]。

除lncRNA外，環狀RNA(circRNA)也具有ceRNA的能力，QIAN等[31]發現，RSA患者絨毛中有8種與健康妊娠期女性差異表達的circRNA，而已有證據顯示circRNA可調控miRNA，表明circRNA可能通過ceRNA機制調節miRNA，從而參與RSA的發生[32]。

4.2基因多態性影響miRNA表達水平 單核苷酸多態性或miRNA編碼區突變可能改變miRNA的表達及成熟情況。而這種現象在多個國家的RSA患者中被證實。miRNA-27a rs895819 A/G多態性中的GA+GG和G等位基因與埃及女性對RSA的易感性增加有關[33]。有學者發現，韓國RSA女性中，miR-27a變體G等位基因風險較低，而miR-449b變體G等位基因與高風險相關[34]。另一項基于韓國女性的研究提示，miR-25 C>T和miR-222 G>T的組合與RSA的發生有關[35]。在針對中國女性的研究中發現，miR-196a-2中的miR-196a-2 rs11614913 T/T可能通過破壞成熟miR-196a-3p的產生和增強二氫葉酸還原酶(DHFR)的表達而導致RSA的遺傳易感性[36]。另一項研究證實，pri-miR-125a編碼區的A>G突變使漢族RSA患者成熟miR-125a表達降低[37]。

5 miRNA檢驗技術的應用與挑戰

生物標志物應提供正常生理狀態或病理過程的關鍵信息，穩定性好，容易通過非侵入性手段獲得，可通過簡單和廉價的方法檢測，且具有良好的特異度。miRNA基本符合這些標準，已被發現在腫瘤、神經系統疾病、心血管系統疾病、病毒感染等疾病中存在變化，從而成為不同細胞事件和疾病診斷、預后和治療監測的有效生物標志物[38]。

準確、可靠、靈敏的檢測方法是miRNA作為新一代生物標志物的前提。目前，分析miRNA最常用的方法都存在其優勢和一定的局限性。qRT-PCR靈敏度高，應用廣泛，但缺乏多路復用和全基因組覆蓋，而且作為基于指數擴增的方法，其中的偏差或錯誤也會指數級擴增而影響實驗結果[39]。印跡雜交(Northern blotting)可用于檢測非擴增的miRNA，但其要求原料量大、放射性強，且靈敏度低、耗時長、勞動強度大[40]。原位雜交可展示細胞或組織切片中的時空分布，但技術難度高、費時，且結果不具體[41]。微陣列技術提供全基因組覆蓋，但需要特定的探頭和專門的設備，數據規范化困難，缺乏不同平臺之間的重現性[42]。新一代測序提供全基因組覆蓋，識別新的miRNA和miRNA中的單核苷酸多態性，但其需要專門的設備、熟練的生物信息學家且數據分析復雜[43]。等溫指數放大靈敏度高，信號放大效率高，不需要熱循環設備，但需要包括切割酶在內的多種酶，且探針設計復雜[44]。DNA四面體、DNA折紙、DNA器件和基元等DNA納米技術可直接檢測miRNA，從而消除任何基于擴增的錯誤，彌補了qRT-PCR和Northern blotting中缺乏多路復用的不足，一些納米技術還可通過對設備、培訓需求的降低從而降低成本和復雜性[38]。

一些miRNA可以在多種不同疾病中朝著相似的方向改變。例如，miR-21表達水平在一些疾病中發生改變，包括心血管疾病、炎癥，以及一些癌癥，包括乳腺癌、宮頸癌、結腸直腸癌、膠質母細胞瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌和皮膚癌[45-46]。因此，需要對循環的miRNA進行全局篩選，以生成針對特定疾病或癌癥類型的miRNA特征，從而提高生物標志物的特異度。年齡、性別、既往治療方案等因素也必須加以考慮。此外，數據再現性是檢測方法、分析方法及數據處理標準化和優化可能產生的另一個主要問題[47-48]。在miRNA可以用作新一代人類疾病的生物標志物之前，miRNA診斷的前景必須與仍然存在挑戰的現實相適應。

6 小 結

綜上所述，miRNA可能通過參與對于妊娠極其重要的血管生成、細胞侵襲和凋亡、免疫平衡及耐受等過程，從而導致RSA的發生，miRNA受表觀遺傳、基因多態性等因素的影響而參與RSA進程。盡管miRNA有希望被應用于臨床，但仍存在許多問題。現有研究大多數集中于miRNA在RSA中的差異表達，但標本處理方式、孕周、標本類型差異較大，還需要更多實驗來確定miRNA參與RSA診斷及治療的具體應用方案。此外，RSA的發病機制及類型較為復雜，對RSA發生發展過程的進一步研究對于miRNA的臨床應用也具有重要意義。希望通過后續研究，可以將miRNA應用于臨床，在RSA的治療方面發揮重要作用。