心臟移植術后血液免疫監測研究進展*

柴軍武 王 凱 孔祥榮

天津市第一中心醫院心血管外科 300110

盡管機械循環輔助不斷完善與發展，心臟移植仍然是終末期心臟病患者的長期治療首要選擇，心臟移植術后患者可獲得良好的生活質量。心內膜心肌活檢(EMB)是心臟移植術后排斥反應監測的金標準。然而，由于EMB檢測的有創性，極大地限制了移植術后免疫抑制程度的監測，這樣就造成無法科學應用免疫抑制藥物，進而影響到排斥反應的發現，而過強的免疫抑制，又會造成感染的發生。經皮心肌內膜活檢(EMB)用于評估心臟移植后排斥反應已經有45年的歷史，其最初局限于急性細胞排斥反應(Acute cellular rejection,ACR)的評估，但近年來，對供體特異性抗體導致急性抗體介導的排斥反應(Acute antibody-mediated rejection,AMR)的作用有了越來越多的認識，AMR患者可能比ACR預后更差[1], 近年來，EMB作為排斥反應的診斷金標準逐步形成共識，然而，EMB仍然有很大的局限性。其侵襲性與手術可能的并發癥風險有關，包括三尖瓣損傷、心肌穿孔和冠狀動脈瘺的發生。即使經驗豐富的病理專家也可能由于取樣誤差，無法評估更深的心肌組織，在同一患者不同標本之間在組織學解釋上也缺乏一致意見，使得該技術的敏感性也有限。然而，活檢仍然是監測和診斷急性排斥反應的金標準。基因表達譜(GEP)的引入可減少了許多患者需要進行活組織檢查的次數，而目前大多數中心仍將EMB作為最初6～12個月監測的主要方法[2]。目前主要血液系統檢測有以下幾個方面。

1 基因表達譜

最近，有研究將分子技術用于評估活檢心肌內的基因表達譜來提高診斷率。目前已開發了一種基于微陣列的系統來評估EMB標本(The Molecular Microscope)。該系統確定了與AMR相關的不同轉錄本，包括自然殺傷細胞轉錄本、巨噬細胞轉錄本、內皮激活轉錄本以及與國際心肺移植學會(ISHLT)病理抗體介導的排斥反應分級密切相關的干擾素轉錄本。這項技術提高了從單個活檢組織進行排斥診斷的可能性，開啟了自動化的可能性，并提供了定量結果。雖然這些進展可提高EMB診斷率，但非侵入性的基于血液的檢測來評估移植排斥反應可能降低成本和并發癥，并允許更頻繁地檢測來評估抗排斥治療的反應[3]。

2 供體特異性抗體

移植時供體特異性抗體(DSA)的存在和移植后新生DSA的發展都與移植后不良反應有關，包括排斥反應、移植心臟血管病變和移植物失功。即使移植后受者的近1/3存在DSA，但DSA的存在并不一定預測AMR的發展。目前ISHLT指南建議移植后1、3、6和12個月時常規監測抗人白細胞抗原 DSA[4-5]。近年來，非HLADSA的研究越來越多，已發現與急性和慢性同種異體排斥反應有關。檢測到的抗原包括主要組織相容性Ⅰ類相關基因A (MICA)、血管緊張素Ⅱ型1受體(ATIR)、內皮素A型受體內皮細胞抗原、波形蛋白(vimentin)、膠原-Ⅴ和非HLA IgM抗體[6]。有證據表明，抗內皮抗體與AMR和移植心臟血管病變的發生發展有關。新生HLA DSA聯合AT1R抗體的發展可能對移植后心臟移植排斥反應的發展有害[7]。目前，這些抗體在急性和慢性排斥反應中的檢測仍在研究中。非HLA抗體在介導同種異體心臟損傷中的臨床意義和作用尚不明確。

3 組織損傷和心臟功能的標記物

許多與微血管血栓形成相關的早期生物標志物(微血管纖維蛋白沉積、血管組織纖溶酶原激活物的消耗、內皮激活和血管抗凝血酶的丟失)以及血清心肌肌鈣蛋白的檢測和血清可溶性黏附分子水平的升高，都與后期移植心臟血管病變相關。在最近一篇評估心肌肌鈣蛋白檢測ACR的研究綜述中，高靈敏度的肌鈣蛋白檢測確定具有高靈敏度(82%～100%)和高陰性預測值(97%～100%)[8]。

在一項前瞻性生物標志物研究中，評估與心肌細胞損傷(肌鈣蛋白)、心功能(鈉尿肽)、纖維化(Galectin-3和ST-2)和心腎功能(Cystatin-c)相關的生物標志物在心臟移植后10d與1年的結果[9]相關。只有胱抑素C和高敏感性肌鈣蛋白T (hsTnT)可預測1年死亡率。此外，在心臟移植后1年左心室射血分數(LVEF)降低的患者中，這兩個與半乳糖蛋白酶-3相關的生物標記物均升高。n末端b型利鈉肽(NT-proBNP)未顯示早期預后情況。在本研究中，沒有測量到的生物標志物預測排斥反應，但至少發生排斥反應的患者心臟移植后12個月，hsTnT和NT-proBNP顯著升高。許多研究表明，成人和兒童心臟移植受者中鈉尿肽的絕對測量值和連續測量值的變化可以預測急性同種異體排斥反應[9-10]。

4 基因測序

第一個臨床可用于評估心臟移植排斥反應的無創血液檢測是利用基因測序(Gene expression profile GEP)。在對已知同種異體免疫途徑和白細胞微陣列的分析中，252個候選基因被確定為實時聚合酶鏈反應(PCR)。在隨后的一項較小的單中心研究(EIMAGE)中，對60名患者在移植后(55d)早期隨機進行GEP或觀察活檢[11]。在排斥反應監測方面，GEP與EMB再次具有可比性，并且沒有導致不良結果的增加。GEP也被證明有助于指導皮質類固醇的停止，在這方面與EMB相似。使用GEP (AlloMap)已被納入ISHLT指南，用于心臟移植后患者的管理，并有助于減少用于監測排異反應的活體組織檢查的數量[12]。

關于GEP的使用，有一些重要的注意事項。這項測試還沒有在移植<55d的患者身上得到驗證。如果患者每天服用> 20mg的強的松，則應避免使用(因為一些被檢測的基因對類固醇有反應)。應避免在治療排斥反應后21d內和輸血后30d內進行該試驗。重要的是，GEP還沒有在抗生素耐藥性患者中進行試驗。因此，EMB仍然是移植后前3個月監測的首選測試，通常在第1個月每周進行1次，然后每2周進行1次。

5 游離DNA

細胞更新的一個不可避免的結果就是DNA釋放到循環系統中。游離DNA (cfDNA)是從健康、炎癥或病變組織中細胞凋亡或壞死細胞中重新釋放的。循環cfDNA自70年前在人類血漿中發現以來，作為一種非侵入性的診斷生物標志物，已成為一個有價值的研究領域。在移植中，對移植受者血液中供體來源cfDNA (dd-cfDNA)的檢測被認為是ACR和AMR損傷的無創標志物。單中心研究表明，心臟移植急性排斥反應后可檢測到dd-cfDNA水平升高，且升高先于EMB的組織學排斥反應[13-14]。

最初的方法是使用全基因組測序來檢測和量化cfDNA，但是分析的復雜性和成本最終限制了它作為臨床有用工具的應用。一種更快速、更具成本效益的監測策略是對dd-cfDNA進行有針對性的定量，但這需要對移植供體進行基因分型，這是不切實際的。利用下一代測序對單核苷酸多態性進行靶向擴增，最近已被證實可以在不需要供體或受體的情況下量化移植受者的dd-cfDNA，基因分型結果[15]。在一項多中心回顧性病例對照研究中，這項技術已被證明可以檢測心臟移植受者的ACR。在腎移植中，一項前瞻性的多中心試驗證明了該技術在檢測急性排斥反應中的有效性[16]。

6 T細胞免疫功能

移植受者的管理面臨的挑戰是平衡免疫抑制，一方面防止感染、惡性腫瘤和藥物毒性等并發癥，另一方面防止移植物急性或慢性排斥反應。單獨的治療藥物監測不足以評價免疫反應，其重要價值是預防藥物毒性。ImmuKnow試驗檢測CD4+T細胞介導免疫，并幫助識別有感染和排斥風險的患者。該實驗在外周血中進行，測量活化淋巴細胞中三磷酸腺苷酶的釋放，幫助預測免疫狀態。它在評估腎、胰腺和小腸等實體器官移植的感染和排斥反應風險方面有一定作用。使用ImmuKnow試驗[17]對來自10個美國中心的500多個實體器官移植受者(心臟、腎臟、腎胰、肝臟和小腸)進行了薈萃分析，從移植后不同時間的受者身上提取血樣，并與臨床過程進行比較。在這項分析中，39例經活檢證實為細胞排斥和66例確診發生感染。免疫應答值為25ng/ml ATP的受體發生感染的可能性是免疫應答較強的受體的12倍。同樣，免疫反應為700ng/ml ATP的受體發生ACR的可能性是免疫反應值較低的受體的30倍。在中等免疫反應區，感染和排斥的比值曲線相交于280ng/ml ATP，這為實體器官接受者的免疫功能提供了一個免疫目標。在一項對近300名心臟移植受者的單中心研究中，在移植后2周～10年間共進行了864次免疫監測分析。感染病例38例，排斥病例8例。感染期間的平均免疫監測評分明顯低于穩定狀態(187ng/ml ATP VS 280ng/ml ATP,P<0.001)[18]。在臨床上，該分析對確定活動性感染期間免疫抑制的程度最有用，如果免疫監測評分較低(特別是< 100ng/ml ATP)，則可指導減少免疫抑制。免疫抑制劑量受藥物不耐受限制的患者，ImmuKnow可提供免疫抑制療效的測定，而不限于治療性藥物監測。如果在無癥狀患者中進行該試驗，由于感染風險高，如果ATP/ml得分< 100ng/ml ATP，則可提示免疫抑制的降低，如果得分升高(>700ng/ml ATP)，則可能需要考慮加強免疫抑制。

7 小結

有效的免疫抑制藥物的應用促進了心臟移植作為治療終末期心臟病的發展。然而，自移植手術開始以來，如何平衡免疫抑制以減少移植排斥反應、藥物毒性、感染和惡性腫瘤一直是挑戰。心肌損傷和功能的生物標志物可以提供更多的數據來幫助確定移植后的移植物功能。GEP用于臨床，減少了對一些心臟移植受者進行活體組織檢查以監測排斥反應的必要性。DSA監測有助于對存在AMR風險的患者進行風險分層，dd-cfDNA有助于在活檢發現組織學變化前識別ACR和AMR風險患者。ImmuKnow試驗在成人心臟移植受者臨床中主要用于評估過度免疫抑制和感染風險。總之，隨著分子技術的快速發展,移植術后監測將逐步完善。