中藥促骨髓間充質干細胞成骨分化的研究進展

李 姣，黃委委，陶 林，張 磊，楊 鋒

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712046；3.陜西高校青年創新團隊，陜西 咸陽 712046）

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs) 作為骨髓中的多能干細胞，在一定的誘導條件下能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等成熟細胞，其多向分化的潛能在連續傳代培養或冷藏后未受明顯影響，是目前發現的較為理想的種子細胞，在組織工程、再生醫學領域有著良好的應用前景。通過近些年對BMSCs 的研究，發現其在治療慢性骨科疾病，以及骨傷后的修復重建的優勢愈發明顯。大量研究選用中藥作為誘導劑，較之以往應用的化學物質和細胞因子，能選擇的作用靶點更廣泛，且更加廉價實用。通過這些研究發現，中藥、中藥復方及其有效成分能夠顯著促進BMSCs 向成骨分化，為臨床應用中藥治療骨缺損性及其他骨科疾病提供了科學依據。本文特從單味中藥、中藥復方、中成藥及有效成分促BMSCs 成骨分化及其機制進行綜述。

1 單味中藥對BMSCs 成骨分化的作用與機制分析

許多中藥及其有效成分（如含藥血清、醇提物、水提物等），均能對BMSCs 的成骨分化起著積極作用。其中一些藥物可提高成骨細胞增殖，或降低、或抑制破骨細胞生成，或具有雙向調節的作用。

1.1 淫羊藿 淫羊藿作為傳統補腎中藥，具有溫補腎陽、強壯筋骨的作用。李智奎等[1]通過采用不同濃度的淫羊藿苷對SD 大鼠分子機制進行研究，認為淫羊藿苷通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，促進成骨分化相關基因核心結合蛋白因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和成骨功能基因骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達，或是對過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、降脂蛋白（Adipsin）和脂肪酸結合蛋白（FABP4）的表達進行抑制，從而促進了大鼠BMSCs成骨分化，并對其成脂分化也有抑制作用。陳花英等[2]研究發現淫羊藿苷能上調高糖環境下的骨鈣素、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原基因表達，通過抑制BMSCs 的凋亡進而促進成骨分化，且能對高糖環境下骨損傷的預后有所改善。

1.2 骨碎補 骨碎補為骨傷科常用中藥，具有補腎、活血、續傷、強骨的功效。其含藥血清、醇提液以及黃酮類物質（主要包括柚皮苷和新北美圣草苷）都具有一定的抗骨質疏松活性。陳云剛等[3]研究發現不同劑量（中等劑量為佳）骨碎補含藥血清通過激活Wnt/β-catenin 信號通路，能明顯上調β-catenin、低密度脂蛋白受體相關蛋白（low-density lipoprotein related proteins 5，LRP5）、Runx2、Osterixm RNA 的表達，下調GSK-3β的表達，提高ALP 的活性，最終實現對BMSCs 成骨分化的促進作用。申意偉等[4]研究發現骨碎補活性成分柚皮苷對BMSCs 的成骨性分化、成骨細胞的增殖和鈣化成熟均有良好的促進作用。

1.3 巴戟天 巴戟天為補陽藥，具有溫補腎陽、強筋健骨的功效。其有效成分包括巴戟天多糖、巴戟天多糖含藥血清及其水提取物等。賴滿香等[5]研究發現巴戟天多糖能夠提高ALP 活性，并增加其礦化結節數，說明巴戟天多糖在一定程度上具有促進大鼠BMSCs 增殖，以及分化為成骨細胞的能力。賴滿香等[6]另一組關于巴戟天多糖含藥血清的研究發現，其含藥血清在這一過程中通過上調核心結合因子ɑ-1（Cbfɑ-1mRNA）的表達，可能是促進BMSCs 向成骨分化的有效機制之一。

1.4 杜仲 杜仲具有補益肝腎、強筋骨之功效。杜仲槲皮素、山奈酚、醇提取物為其主要有效成分。陳林攀等[7]研究杜仲葉提取物槲皮素對SD 大鼠BMSCs增殖的影響及其分子機制進行了研究，結果發現槲皮素對BMSCs 增殖促進作用，認為其機制可能是槲皮素通過激活細胞外信號調節激酶（extracellular signalregulated kinas，ERK）磷酸化。林奇生等[8]研究杜仲醇提取物可提升BMSCs 內RhoA/ROCK 信號路徑ROCK1、RhoA mRNA 表達量，從而促進BMSCs 成骨分化和增殖。趙晶等[9]研究發現杜仲提取物山奈酚可促進成骨細胞增殖，誘導BMSCs 分化為成骨細胞。

1.5 補骨脂 補骨脂是常用的補腎壯陽藥，香豆素類物質為其主要有效成分。韓宇等[10]研究不同劑量補骨脂甲素通過調控cAMP/PKA/CREB 信號通路，上調PKA、CREB mRNA 及蛋白表達，促進大鼠BMSCs 成骨分化及增值，其中以補骨脂甲素高劑量組作用效果最優，這說明補骨脂甲素能夠促進BMSCs向成骨分化，其主要機制可能是cAMP/PKA/CREB 信號通路的活化所誘導。韓宇等[11]另一研究為補骨脂素可能通過調控Hedgehog 信號通路，促使音猬因子（Ssonic hedgehog，Shh）、Gli 家族鋅指蛋白-1（Gli family zinc finger-1，Gli-1mRNA）表達上調，Ptch1mRNA 及蛋白表達下調，而促進大鼠BMSCs 成骨分化及增殖。

1.6 女貞子 女貞子為常用滋陰藥，具有滋補腎陰，強腰膝的功效。女貞子主要活性成分是齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、苷元酪醇等。研究表明，女貞子通過對信號通路的基因轉錄激活或抑制，促進成骨細胞分化、增殖，且能抑制破骨細胞的活性，提高骨組織膠原數量[12]。戰美等[13]研究的女貞子提取物、20 μg/mL 特女貞苷、女貞苷G13 和油女貞苷，均能提高BMSCs 的ALP 活性，且20 μg/mL 3 種成分使鈣化結節數量增加，提高了骨鈣素（bone gla protein,BGP）、Runx2 和LRP6mRNA 表達。女貞子提取物及其3 種成分可能通過誘導Wnt/LRP6/β-catenin 通路的激活促進BMSCs 向成骨細胞分化，是發揮抗骨質疏松活性的主要機制。

1.7 黃芪 黃芪作為補藥之長，具有補氣、生肌、利尿等功效。香豆素、黃酮類、黃芪多糖是其主要有效成分。研究表明，通過維生素D 軸（ⅤD/ⅤDR）對成纖維細胞生長因子23（FGF23）-Klotho 軸的調控作用，能有效改善衰老的BMSCs 活力和骨形成[14]。王磊等[15]研究發現BMSCs 受到X 線輻射后，其向成骨細胞分化的潛能明顯受到抑制。提前給予黃芪多糖（50 μg/mL，干預3 d）被X 線輻射進行培養，結果顯示BMSCs 向成骨方向分化的潛能得到保護。胡繼宏等[16]研究采用適宜濃度的黃芪多糖、黃芪注射液、黃芪甲苷，3 種物質均可促進大鼠BMSCs 增殖。

1.8 其他單味中藥 曾建春等[17]發現肉蓯蓉對大鼠BMSCs 增殖和誘導其向成骨分化均具有促進作用。時舒曼等[18]研究使用銀杏葉提取物對大鼠BMSCs 成骨分化進行干預，發現其具有促進大鼠BMSCs 成骨分化的作用。謝興文等[19]研究發現，在不同劑量麝香干預下，在細胞胞漿內I 型膠原表達不同，低劑量對BMSCs 成骨誘導分化后表達影響最顯著，說明麝香具有促成骨細胞的生成。除此之外，尚有研究表明，葛根素能通過抑制絲（蘇）氨酸蛋白酶（serine/threoninekinase,Akt）活化，能對脂多糖誘導的破骨細胞形成和骨丟失有效預防[20]。張海玲等[21]研究發現龜板成分中的S6、S8、S9，通過表達Id1 能促進BMCSs的增殖，而S2、S3 則抑制其增殖，說明在一定條件下，龜板既可促進BMCSs 的增殖，又可抑制BMCSs 使其不過度增殖。

2 中藥復方對BMSCs 成骨分化的作用與機制分析

辨證論治自古即是中醫辨病、治病的基本原則，中藥復方正是以此為基礎，辨證審因、遣方用藥，對藥物有機配伍組合。中藥復方在目前臨床所進行的實驗研究中，主要是采用其含藥血清對體外細胞的誘導培養。

2.1 右歸丸 高舉會等[22]研究采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測各組細胞中的Shh、12 次跨膜蛋白（Ptched，Ptc）、Gli-1mRNA，證實了右歸丸可以通過激活Hedgehog 信號通路Shh、Ptc、Gli-1mRNA 的表達，從而促進BMSCs 向成骨分化。由此可知，右歸丸促進BMSCs 向成骨分化，可能是由激活Hedgehog 信號通路中各表達這一重要機制所誘導的。徐強等[23]研究發現采用不同劑量的右歸丸含藥血清，對BMSCs 中p-Akt、p-mTOR磷酸化水平水平均有不同程度的提高，從而發揮其促進BMSCs 骨向分化的作用。楊鋒等[24]研究發現右歸丸含藥血清對BMSCs 成骨分化具有促進作用，并在一定程度上能抑制BMSCs 成脂分化。

2.2 左歸丸 李宇等[25]研究發現左歸丸含藥血清能夠上調轉錄激活因子（activating transcription factor-4，ATF4）、BGP 和BMP 的蛋白濃度，并且能夠誘導BMSCs 向骨細胞分化，從而能夠起到防治骨質疏松癥的作用。楊鋒等[26]研究左歸丸含藥血清可通過去甲基化的表觀遺傳調控機制，促進BMSCs 向成骨細胞分化。此過程中發現通過左歸丸含藥血清可以上調成Runx2、Osterix、BGP 和β-catenin 的表達，而其DNA 甲基化水平則明顯下調。由此可知，左歸丸可以通過下調成骨基因甲基化率，促進基因的高表達，使BMSCs 向成骨方向分化。陳東陽等[27]研究說明左歸丸可以通過G 蛋白偶聯受體信號通路，發揮對骨形成蛋白 6（BMP6）及活化因子4（ATF4）的調節作用，從而促進BMSCs 向骨細胞分化。

2.3 補腎活血湯 李新建等[28]所研究的補腎活血湯（藥物組成：熟地黃9 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，補骨脂9 g，菟絲子10 g，歸尾3 g，沒藥3 g，山茱萸3 g，紅花1.5 g，獨活3 g，酒制肉蓯蓉3 g）防治激素性股骨頭缺血壞死的機制研究，發現其含藥血清能抑制兔BMSCs 成脂分化，同時具有促進BMSCs 成骨分化，或誘導脂肪細胞轉化為成骨細胞。劉亞梅等[29]的研究運用補腎活血湯（組方同上）含藥血清干預后，發現處于增值分裂期（S+G2+M 期）的BMSCs 百分率明顯增高，說明補腎活血湯含藥血清具有促進BMSCs 增殖活性的作用。張倍源[30]的研究通過將補腎活血方水提液稀釋到所需濃度，發現能通過下調miR-210 表達，使鈣化結節數量增加，從而促進BMSCs 向成骨分化，表明補腎活血中藥能有效改變局部骨組織，以及細胞生長的微環境，改善局部微循環、缺血缺氧。

2.4 黃芪散 王芳等[31]研究發現梯度劑量黃芪散（黃芪散是治療消渴病的古方，源自北宋《圣濟總錄》由葛根、黃芪、桑白皮3 味藥按質量比2:1:1 的比例組成）含藥血清能調節OPN、BGP、ALP、成骨分化相關基因核心結合蛋白Runx2 和成脂分化相關基因PPARγ表達，從而促進BMSCs 增殖及成骨分化，研究提示黃芪散含藥血清隨著劑量的增大，促進BMSCs 更多向成骨方向分化，且減弱成脂分化趨勢。

2.5 二仙湯 劉波等[32]研究發現二仙湯（仙茅、淫羊藿、巴戟天、當歸、知母、黃柏）通過改善氧化刺激對成骨細胞骨形成的影響，促進成骨細胞骨形成，其機制可能與二仙湯調節鈣離子通道有關。吳琪等[33]研究通過MTT 法檢測發現不同劑量二仙湯能明顯提高去卵巢骨質疏松大鼠BMSCs 增殖，中等劑量二仙湯的改善作用最為顯著，并采用堿性磷酸酶試劑盒測定發現堿性磷酸酶活力、礦化鈣結節形成能力均得以提升高。表明二仙湯可能是通過促進BMSCs 的生長，改善其骨向分化能力，促進骨形成，達到對骨質疏松癥的防治作用。

2.6 其他中藥復方 劉伯齡等[34]研究說明透骨消痛顆粒含藥血清通過上調Sox9 的表達，能加速BMSCs向軟骨細胞分化。單獨使用較跟軟骨誘導劑合用效果稍弱，后者更能增強BMSCs 向軟骨細胞的分化，且促進Sox9 的表達也更明顯，同時還能增加細胞的collagen Ⅱ、collagen X 表達，這可能是其主要機制之一。賈峰等[35]研究亦發現透骨消痛顆粒含藥血清可有效促進BMSCs 中Sox9、Collagen Ⅱ和Runx2 轉錄水平的升高，有效誘導BMSCs 向軟骨細胞分化。提示透骨消痛顆粒含藥血清可通過升高Sox9 和Runx2 表達水平，參與誘導分化軟骨細胞的信號通路過程，且在一定程度上抑制BMSCs 向肥大的軟骨細胞分化，而表現為終末細胞表型。鄔波等[36]通過體外分離大鼠BMSCs，采用不同劑量復方接骨片和壯骨片含藥血清進行培養，以RT-PCR 法檢測得知BMP-2、Runx2、ⅤEGF 及Akt mRNA 的表達明顯上調，Western blot 法檢測得知BMP-2、Runx2、ⅤEGF 及Akt 蛋白的表達也呈增高，說明其含藥血清可在BMSCs 體外分化通路中起到協同促進BMSCs 向成骨細胞分化的作用。宋永周等[37]體外分離培養大鼠BMSCs，通過MTT 法檢測發現含抗骨增生膠囊含藥血清可促進大鼠BMSCs 增殖，以高劑量組效果最為顯著。堿性磷酸酶活性測定結果顯示，對分泌堿性磷酸酶的促進作用也更好。茜素紅染色結果顯示高劑量組形成的鈣鹽結節更大、更致密。由此可知，高劑量組含抗骨增生膠囊血清可顯著促進大鼠BMSCs 的增殖和向骨向分化。

3 小結

從以上研究積極探索中藥對BMSCs 成骨分化的調控作用的結果得知，單味中藥、中藥復方及其有效成分對BMSCs 的增殖和向成骨分化均具有一定的促進作用，其中尤以補腎類方藥的運用居多。通過觀察發現，補腎類中藥對BMSCs 向不同細胞分化的促進作用，在一定程度上與中醫辨證論治理念相吻合，其中中藥復方更能體現這一中醫特點。目前，通過一系列對中藥促進BMSCs 向成骨分化的研究，使中藥中許多藥理成分及藥理作用被發現，且進一步得到證實，雖然取得的成果頗多，但仍存有一些問題亟待解決：1）年齡的增長，導致BMSCs 增殖分化能力下降，加上其他方面的限制，如倫理因素，BMSCs 本身取材困難、分化不定向等，造成了種子細胞不能在短時間內大量獲取，給研究增加了困難；2）中藥及中藥復方提取物所含成分復雜，為了能更好對調控機制進行研究，仍需對具有誘導分化作用的成分再研究、再確定，含藥血清成分更為復雜，目前關于中藥及中藥復方對含藥血清的研究頗多，其制備的標準、操作規程、質控體系都需要進一步完善；3）在臨床應用研究過程中，由于首過效應，以及受藥物本身生物利用度的影響，通過口服方式在體內的血藥濃度，其劑量選擇無法達到體外研究標準，尚未發現對骨科疾病防治的相關文獻；4）中藥作用于BMSCs 成骨分化各個細胞信號通路的分子機制，各信號通路與通路、因子與因子之間是否存在協同與拮抗作用，雖然一些研究結合了藥代動力學、轉錄組學、蛋白組學等，但得到的結論尚不能確定，因此，深入研究中藥誘導BMSCs 向成骨分化作用勢在必行。比如此過程中是何種有效成分發揮作用，其主要機制通路和作用的靶點等，仍需進一步研究探討，以便為今后臨床應用中藥誘導BMSCs 成骨分化治療骨科疾病提供更多、更可靠的依據。