病原微生物耐藥性新型檢測技術的研究進展

曹 陽， 陳 薇

病原微生物對抗菌藥物耐藥性的日趨增高是對全球人類健康的主要威脅，而對其快速檢測、定量分析及結合抗菌藥物管理，是控制耐藥性出現和傳播的關鍵干預措施。但目前臨床微生物工作中使用更多的還是表型抗菌藥物敏感性檢測（antibiotic susceptibility testing，AST），多為肉湯微量稀釋法、紙片法等。這些方法需要較長的孵育時間，不能及時指導抗感染治療。近年來開發了一些新型的技術應用于耐藥菌檢測，現將相關的新興檢測技術綜述如下。

1 分子生物學技術在耐藥性檢測中的應用

1.1 耐藥基因核酸檢測

現有多種新型耐藥性檢測的分子生物學方法，如核酸探針微陣列[1]，等溫核酸擴增技術[2]，PCR擴增產物高分辨率熔解曲線分析，以及將菌種鑒定、熔解曲線和機器學習（machine learning technique）相結合的方法[3]。基于核酸擴增技術的耐藥基因檢測方法可以縮短報告時間，早期進行抗菌藥物調整進行靶向治療。有許多商品化儀器如全自動檢測分析系統GeneXpert利用PCR技術可檢測mecA和/或mecC基因，該系統還可以檢測萬古霉素耐藥基因vanA和vanB以及針對直腸拭子中碳青霉烯類耐藥基因KPC、NDM、VIM、OXA48 和IMP的篩查[4-6]，GeneXpert系統高度整合樣品制備、擴增及檢測于一個獨立的試劑盒中，并將其自動化，只需很少的人工操作，但受熒光通道限制，通常只能同時報告2～6種靶標。近年來，數種新的多重擴增檢測系統可以同時進行菌種的鑒定和耐藥基因的檢測。BioFire公司的 FilmArray BCID 檢測系統采用巢式多重PCR的原理，將核酸提取、PCR擴增和產物檢測集成到一個封閉的測試條中，可檢出來自血培養中24種常見的菌血癥病原菌和3種耐藥基因mecA、vanA/B和KPC，該系統根據不同測試條組合，最多可同時報告43種病原體/耐藥基因結果。Curetis Unyvero系統采用多重PCR技術用于肺炎、植入物和組織感染、血流感染和腹腔內感染的診斷，包含更為全面的病原體和耐藥基因檢測模塊[7-8]。Nanosphere VERIGENE系統利用金納米顆粒探針技術，應用在陣列和擴增兩種方法中，相對熒光基團靈敏度更高，目前檢測試劑盒涵蓋了血流感染、胃腸道感染和呼吸道感染，2 h內提供檢測結果。針對血培養陽性的標本，具有兩種卡盒分別檢測革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，該系統也包括一些耐藥基因（mecA、vanA、vanB、CTX-M、KPC、IMP、NDM、OXA和VIM）的檢測[9]。耐藥性的分子檢測方法具有快速與覆蓋范圍廣的特點，其臨床使用變得越來越廣泛。

1.2 耐藥性蛋白質標志物檢測

并非所有檢測耐藥性的分子生物學方法都是基于核酸。現已報道了多種直接檢測耐藥性蛋白質標志物（例如β內酰胺酶）的方法，如特定蛋白芯片[10]。這些方法通常使用抗體來捕獲和富集蛋白質，可用熒光標記抗體或蛋白質便于觀察，但抗體與耐藥性蛋白之間的相互作用需要優化。目前已經開發了多種側向層析檢測（LFA）產品用以檢測β內酰胺酶。其中一項針對新德里金屬β內酰胺酶NDM-1的LFA檢測，共收集了來源于緬甸的350株細菌，結果顯示具有100%的靈敏度和特異度[11]。在其他類似的研究中，有聯合檢測OXA48、IMP、NDM和VIM酶的LFA，還有針對mcr-1酶的LFA，研究結果都非常理想[12-13]。雖然目前已經開發出多種可有效檢測和鑒定耐藥性相關大分子的方法，但檢測的靶目標過于單一，無法掌握細菌的全部耐藥信息。

1.3 全基因組學耐藥性檢測

目前在分子診斷領域，出現了一種傾向使用基因組學方法來鑒定細菌種類和抗菌藥物耐藥性的趨勢。隨著測序技術的進步，應用全基因組測序，再加上生物信息學工具快速收集和分析這些測序得到的數據，基本上可以追蹤導致細菌耐藥的所有基因。但值得注意的是將生物信息學數據與不同的數據庫結合使用可能導致不同的檢測結果[14]。目前基因組學檢測常規應用的最大障礙是缺少成本低廉的測序平臺以及對用戶“加入樣本，輸出結果”的生物信息解決方案。近來，引起廣泛關注的納米孔測序技術，該技術相對易于使用，并且生物信息學的界面已取得實質性進展[15]，該技術產生的序列很長，可以更容易組裝成完整的基因組，并且能夠鑒定質粒和大規模的基因組重排，但在準確性上仍落后于其他測序技術，而新的算法（例如機器學習）可以糾正這些缺陷。全基因組測序大大提高了基因型與表型之間的符合性，但這需要不斷地通過表型和基因型方法篩選新的耐藥性機制和標志物、成熟的數據庫以及開發可視化智能軟件等才能逐步實現。

2 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF MS）檢測

近年來，雖然臨床微生物的鑒定越來越多通過MALDI-TOF MS來完成，但是耐藥性檢測仍很大程度上依賴于傳統或分子生物學技術。目前已有許多研究者在使用MALDI-TOF MS或其他質譜技術進行耐藥性檢測的研究，其中一些研究尚處于原理證明階段，但另一些已經完成了商業化。

2.1 檢測細菌的耐藥性標志物

通過質譜進行耐藥性檢測最直接的方法是檢測細菌內的耐藥蛋白（如β內酰胺酶)與發生改變或被修飾的細胞組分，根據耐藥菌與敏感菌的質譜峰圖存在的單個峰值或峰簇差異進行區分。β內酰胺酶有多種類型，序列變異性高、分子量范圍從25～40 kDa，使用MALDI-TOF MS可以檢測到質量超過數百kDa的蛋白質，但通常僅在純化和濃縮步驟之后才能檢測到。Chang等[16]使用爆轟納米金剛石處理樣本后，能夠檢測到鮑曼不動桿菌分離株中的碳青霉烯酶特征峰（m/z 40 279±87），但15株敏感菌中有4株在此質量范圍內也顯示信號。Espinosa等[17]使用芥子酸為基質的雙層樣本制備技術處理大腸埃希菌，經質譜分析發現在所有產CMY-2型AmpC酶的菌株中都存在（m/z 39 800）峰，而對照組中沒有發現，靈敏度和特異度都達到了100%。這種方法還可用于檢測陽性血培養物中的KPC-2型碳青霉烯酶（m/z 28 544）。

黏菌素的耐藥機制多與脂多糖修飾有關，而脂質A是脂多糖結構的重要組成部分，當通過至少一個磷酸基團的取代修飾脂質A時，黏菌素與脂多糖的相互作用會降低[18]。質粒編碼的磷酸乙醇胺轉移酶可導致脂質A的修飾，耐黏菌素大腸埃希菌與質譜中野生型脂質A的峰相比，脂質A分子中的這些修飾可以對應其1 796 m/z 相對分子質量+123處的峰[19]。在肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌中也可以檢測出類似的質譜峰漂移[20]。

2.2 監測抗菌藥物的降解

將質譜作為追蹤抗菌藥物降解的工具，是分析臨床分離菌株耐藥性的另一種策略。將疑似含有抗菌藥物水解酶的細菌暴露于抗菌藥液中，在適當的溫度下孵育預設的時間，離心后收集樣品，并將少量上清液轉移至靶板上，使用MALDI-TOF MS分析并記錄抗菌藥物代謝的動力學。這種方法主要針對β內酰胺酶水解活性的檢測，因其結果是基于β內酰胺類抗生素和β內酰胺酶水解產物的峰高比發生變化而獲檢測，故不適用于非產酶耐藥機制的細菌[21]。MALDI-TOF MS并不是完全定量的方法,使用內標進行定量分析最多只能得到半定量結果。這意味著在估算代謝率時，將考慮峰高或峰面積之比，而不是真實的濃度值。因此，在未能得出明確的陽性信號之前，抗菌藥物代謝反應都必須持續進行下去。這種檢測與細菌的接種菌量有關，即如果細菌接種物濃度足夠大，大多數碳青霉烯酶在不到一個小時內即能迅速獲得檢測結果。如Kawamoto等[22]選擇美羅培南為底物，檢測了145株腸桿菌科細菌的碳青霉烯酶，即對美羅培南的水解反應，結果顯示所有攜帶IMP金屬酶的菌株都被正確的識別為陽性，即使是有較低美羅培南MIC值（1 mg/L）的菌株；而所有不攜帶IMP金屬酶的菌株即使美羅培南MIC值很高（4 或8 mg/L）也被識別為陰性。也有研究者利用MALDI-TOF MS直接在報警的陽性血培養中快速檢測產碳青霉烯酶的細菌，結果都令人滿意[23]。對于水解活性低的OXA酶，孵育時間和催化物的添加也有至關重要的作用，Rapp等[24]發現將含有OXA酶的不動桿菌孵育時間延長到12 h，可以得到100% OXA酶檢測陽性的靈敏度，而Papagiannitsis等[25]指出添加碳酸氫銨可以提高OXA-48酶的反應活性，有助于質譜的檢測。

2.3 抗菌藥物作用下微生物的生長檢測

該項技術可能是最接近常規抗菌藥物敏感性檢測的技術，并且可以提供分離菌株藥敏結果而不是其耐藥性信息。目前已經提出了幾種方案，其中已商業化的MBT-ASTRA 似乎是最有希望的一種。該方案將菌株在有或無抗菌藥物的條件下孵育，裂解細胞時加入穩定的蛋白質作為內標，便于測量多肽和小蛋白的數量，這些數量與菌株的數量有關，因此也與菌株的生長有關。通過對質譜峰的定量分析，依據整體質譜峰曲線下面積，計算相對生長比值以檢測細菌是否耐藥。Lange等[26]對108株克雷伯菌屬分離株的研究發現，在美羅培南濃度為8 mg/L的培養基中孵育1 h后，利用MBT-ASTRA方案檢測，與E試驗結果相比靈敏度為97.3%，特異度為93.5%，該方法也適用其他多種細菌與抗菌藥物的組合。近期又提出一種新的方法，為直接靶向微滴生長試驗（microdroplet assay）[27]，該方法是將數微升細菌懸液微滴直接加到有或無美羅培南的靶孔上孵育3 h后，將培養基與細菌分離，進行MALDI-TOF MS檢測，結果通過軟件分析。如無抗菌藥物添加的生長對照細菌鑒定評分≥1.7，則判定實驗結果為有效，因此有抗菌藥物的細菌鑒定評分≥1.7 判定為耐藥，＜1.7為敏感。這樣可以進行多個抗菌藥物濃度的測試，從而更接近CLSI或EUCAST指南中標準，而不是僅測試單一濃度。最近，Correa-Martinez等[28]對微滴生長試驗進一步改進，它具有完整的抗菌藥物濃度（0.25～512 mg/L）并加入了β內酰胺酶抑制劑（棒酸）。對于微滴生長試驗，手動去除液體培養基和接種密度等可能造成的不確定性也要予以關注。

3 新型工程技術在耐藥性檢測中的應用

3.1 基于磁珠的耐藥性檢測

密歇根大學的研究人員開發了異步磁珠旋轉（asynchronous magnetic bead rotation，AMBR）傳感器，以測量單個細菌細胞的生長和藥物敏感性[29]。其原理是將磁珠放入細菌懸浮液中，并置于外部旋轉磁場內以控制磁珠的旋轉。隨著時間的流逝，細菌會附著在珠子上，形成珠-細菌復合物。由于細胞分裂引起細胞長度發生變化，而旋轉動力學也發生變化。加入抗菌藥物后，受影響的生長動力學曲線在旋轉動力學中產生獨特的可檢測特征，通過測量這些扭矩變化，可檢測到細菌長度的變化。后期他們使用了自組裝的簇狀磁性微粒來檢測鏈霉素和慶大霉素對大腸埃希菌的MIC，該方法在短時間內（1.5 h）可以清楚地測量出細菌生長的微小變化。但是，此過程需要特定的懸浮培養物，并且對于較高濃度的細菌無效。

3.2 納米機械傳感器

納米機械傳感器是一種超靈敏振蕩器，用于測量由特定目標物質吸附或選擇性結合到所研究的基質或樣品上而引起的質量變化。其中原子力顯微鏡（atomic force microscopy）是應用最廣泛的納米機械傳感器。不同濃度的抗生素，可以對菌體細胞產生不同的影響，從表面出現小孔到細胞壁完全溶解。有研究者已使用原子力顯微鏡成功測量了抗生素作用下敏感細胞的形態變化，但該方法不提供實時AST結果。Longo等[30]已經開發了一種帶有原子力顯微鏡尖端的微懸臂梁來研究細胞的微運動，將細菌附著到懸臂的表面，并測量其動態波動，通過測量波動幅度，研究在抗生素作用下大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的納米尺度運動及其代謝活性從而獲得MIC/MBC結果。

3.3 微流體技術

微流體技術可以將多種功能（細菌培養、核酸雜交與擴增及細胞裂解等）合并到1個芯片上，也稱為“芯片實驗室”，通過各種方式監測微流體中生物樣本的物理或化學行為變化。2014年，Weibull等[31]開發了具備納升孔的微流體設備，使用光密度測量，實時觀察納升孔中大腸埃希菌在環丙沙星、頭孢噻肟和氨芐西林作用下的生長情況，并采用一種新的數學算法計算細菌生長的遲緩期，從而可在4 h內獲得MIC。為了減少AST時間，Kaushik等[32]開發了基于微滴微流體技術的熒光設備，該設備具有內置的孵育區，可在1 h內提供抗菌藥物有效性檢測結果，是目前最快的表型抗菌藥物有效性檢測設備之一。在微流體技術的基礎上，又開發了多種新的技術，如梯度微流體、微流體pH傳感器、應激誘導微流體等，都在快速檢測細菌耐藥性上做出了大量的嘗試。

除了以上介紹的新型耐藥性檢測技術外，還有拉曼光譜法、流式細胞術、表面等離子體共振、阻抗譜技術等多種新方法。相信在未來，新興的技術會更加成熟和完善，為患者感染性疾病的快速診療帶來希望。