阿爾茨海默病中的β 淀粉樣肽與氧化應激

邵思邁,史 洺,余姊陽,原 野,游言文,郝 莉,張紫娟,張振強*

(1.河南中醫藥大學基礎醫學院,鄭州 450046;2.河南中醫藥大學中醫藥科學院,鄭州 450046)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的兩個典型病理特征分別是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP) 的水解產物 β 淀粉樣肽(amyloid-beta protein,Aβ)組成的胞外老年斑(senile plaque,SP)和微管穩定蛋白質(Tau)病理性磷酸化改變組成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)[1]。 越來越多來自遺傳代謝、體內成像和生化研究的證據表明,寡聚、可擴散的Aβ 肽組合體的累積是AD 發生發展過程中的早期事件,甚至是啟動病理性級聯反應的關鍵[2]。

當氧化還原平衡被打破, 過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在腦內產生、蓄積,使腦細胞膜系統的蛋白、脂質和DNA 等大分子發生氧化,即氧化應激(oxidative stress,OS)。 研究表明Aβ淀粉樣聚集會使線粒體氧化還原活性降低,引發ROS 累積[3]。 毒性Aβ 誘導的受損線粒體能通過觸發N-甲基-d-天冬氨酸受體依賴的Ca2+流,導致大量ROS 的產生,而ROS 增加引起的氧化應激和許多抗氧化酶系統功能損傷與AD 發展有著重要聯系[4]。此外,氧化應激會進入惡性循環,因為氧化產物ROS 會造成生物大分子的破壞,進一步導致更高水平的ROS 積累。 故下文重點論述了AD 中毒性Aβ的產生機制,大分子氧化及Aβ 誘導氧化應激的過程,希望闡明AD 發生發展過程中淀粉樣肽與氧化應激的關系,希望對今后阿爾茨海默病抗氧化劑靶向研究有所幫助。

1 Aβ 產生和神經毒性

Aβ 是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)酶切產生的肽片段,也是AD 患者腦組織內老年斑的主要成分。 淀粉樣蛋白級聯學說認為,Aβ 沉積不僅會形成老年斑,而且沉積后纖維化且有神經毒性的Aβ 是AD 產生的重要原因[5]。

APP 是一種特別存在于中樞神經系統(central nervous system,CNS)中的大分子跨膜糖蛋白,其表達可因氧化應激而增強。 在APP 結構中存在多種特異性的水解位點,β/γ 位點的裂解酶切可產生有神經毒性的、具有 40 或 42 個氨基酸的肽段:Aβ1-40/42(Aβ40/Aβ42)[6],而 γ-酶切位點的水解產物含有完整 Aβ 序列,可產生 Aβ1-42[7]。 APP 水解的發生主要通過Aβ 生成途徑與非Aβ 生成途徑[8]。其中Aβ 生成途徑是一個連續兩步的蛋白水解步驟:首先由β-位點APP 裂解酶1(BACE1)通過切割APP 產生含有99 個氨基酸殘基的羧基末端片段(CTF-β),再經γ-分泌酶作用產生由39~43 個氨基酸組成的毒性 Aβ 和 CTF-γ[9]。 該途徑的主要分泌產物為40-氨基酸形式的Aβ(Aβ1-40)和羧基端含有兩個殘基的次要42-氨基酸形式,即Aβ1-42,而后者也被認為是阿爾茨海默病發病的起始分子[10]。

Aβ1-42二聚體是Aβ 蛋白寡聚體中最小的聚合單位,也是最小的毒性單位。 Aβ1-42在磷酸鹽緩沖液中稀釋后能迅速形成纖維,而Aβ1-40孵育48 h 后才能形成纖維且不能形成雜亂肽(雜亂肽即亂序重排肽,是將自然肽氨基酸序列打亂重排產生的新肽,其氨基酸組成與自然肽相同但序列不同,是缺陷產物的一種)[11-12],所以 Aβ1-42比 Aβ1-40更易聚集,沉積時間也更早、更穩定。 在單體和纖維結構的直接激發下,可溶性β-構象誘導神經元損傷的研究結果表明只有寡聚體物會對神經元有損傷。 也有研究表明氧化應激不僅會引發神經毒性,而且會增強 Aβ 的寡聚化程度[13]。 螺旋 Aβ1-42的長度更長、偶極矩更大,所以與Aβ1-40相比具有更高的螺旋穩定性。 高穩定性為自由基誘導脂質過氧化提供了更多時間,也為Aβ1-42是肽最重要的氧化應激位點的觀點提供了證據[14]。

2 Aβ 與生物大分子過氧化相關

除病理狀態下腦部出現的神經原纖維增粗雙螺旋纏繞扭曲狀態, 即神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle,NFT)外,AD 患者腦中氧化還原平衡狀態也會發生改變[15]。 ROS 是氧被部分還原的衍生物,包括氧自由基及其歧化產物[16]。 神經元細胞新陳代謝活躍,在代謝過程中的耗氧量約占人體總量的四分之一,其含有的抗氧化分子水平也更低,所以神經元細胞受 ROS 超負荷的影響最大[17-18]。 ROS 會隨著時間的推移逐步累積,并導致過度暴露于ROS 及累積效應的細胞受損退化[18],這也是氧化應激誘發神經退行性疾病假說的依據。研究表明神經元易受細胞衰老微環境影響,Aβ 沉積可通過產生過量的ROS 來誘導細胞老化[19]。 呼吸爆發也稱氧化爆發,是免疫系統中的一種氧依賴性殺菌途徑,這一途徑會生成大量自由基,進一步加劇Aβ 的沉積,形成惡性循環。 在ROS 誘導氧化應激的過程中,有神經毒性的ROS 會攻擊蛋白質、核酸和脂質膜,使細胞的功能和完整性遭到破壞。這一過程也使氧自由基大量形成,并與鄰近脂肪酸鏈的氫分子不斷結合形成脂氫過氧化物,使脂質過氧化過程不斷循環。 所以氧化應激多表現為蛋白質過氧化、脂質過氧化反應產物和神經毒性物質(如Aβ1-42)的形成及核酸的過氧化修飾[20]。 Aβ1-40和Aβ1-42水平的升高也與海馬和皮質中蛋白質、脂質和核酸的氧化產物水平增加有關[21]。

2.1 Aβ 誘導的蛋白質過氧化

AD 中的蛋白質氧化主要可分為羰基化和硝基化。 在APP / PS1 雙轉基因小鼠實驗中,培養的原代神經元對外源Aβ1-42誘導的氧化應激與亞硝化應激的敏感性增加[22]。 在早發性AD 病人額葉皮質中觀察到蛋白質羰基水平增加引起了酶的誘導反應,同時脂質過氧化物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)等水平升高[23]。 另一項實驗中檢測到AD 腦中蛋白質硝基化、 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)水平均顯著增加,這兩者的一致上調表明硝基化在AD 發生發展中起作用[23]。

2.2 Aβ 誘導的脂質過氧化

過度的脂質過氧化是大多數神經退行性疾病的標志。 脂質過氧化物(lipid peroxide,LPO)是不飽和脂肪酸與ROS 結合的產物,會通過非酶解作用產生有強毒性的4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE)。 用與AD 患者腦組織類似濃度的4-HNE 誘導神經元觀察到神經元內的 Aβ 明顯增加2~6倍[24]。 胚胎成纖維細胞被過氧化氫誘導可引起細胞中4-HNE 水平增加,γ-分泌酶活性上調,從而加劇APP 的裂解。 過氧化的低密度脂蛋白受體相關蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)能使Aβ 被清除能力下降,導致 Aβ 聚集。而與此結論一致,4-HNE 綁定跨膜的LRP1 后,AD患者腦中Aβ 含量在海馬區顯著增加[25]。

2.3 Aβ 誘導的核酸(DNA 和 RNA)過氧化

在AD 發病所涉及的機制中,氧化應激反應造成的細胞成分的破壞是關鍵因素。 核酸的氧化標記物為定位在Aβ 聚集形成的SP 和NFT 上的8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)和 8-羥基鳥苷 (8-hydroxy-guanosine,8-OHG)。 8-OHG 在早發性AD 病人海馬和額葉皮層中表達的增加證實了核酸過氧化與Aβ 聚集相關[26]。 有臨床實驗采用超高效液相色譜-串聯質譜法測定了80例患者DNA 的氧化產物,其中8-OHdG 和8-OHdG/2dG 的比值在AD 和健康者間的差異有統計學意義,可推測 DNA 氧化是 AD 的早期分子途徑[27]。RNA 氧化,尤其是額葉皮質的mRNA 氧化也會在AD 中發生[28]。 同時 Nunomura 等[29]也提出,盡管神經元RNA 氧化基本上是與年齡相關的現象,但RNA 損傷與 AD 前驅階段認知障礙的發作明顯相關。

3 Aβ 誘導氧化應激

Aβ 是AD 發生發展中神經元損傷與氧化應激之間的橋梁。 桑德斯-布朗衰老研究中心發現:在AD 中,富含Aβ1-42的腦區氧化應激和大分子過氧化水平升高,而在 Aβ1-42較少的腦區則相反[30]。 Aβ會導致蛋白質被氧化修飾、功能降低并使其發揮作用的關鍵生化和代謝途徑受損:包括葡萄糖代謝途徑、mTOR 激活途徑、蛋白質平衡網絡和蛋白質磷酸化等[30]。 在 AD 發展過程中,APP 產生 Aβ 時會產生大量自由基;Aβ 也可以直接誘導神經元產生自由基;氧化應激誘導神經元發生脂質過氧化,并由它們的降解產物進一步氧化修飾亞細胞結構,影響神經元的功能和細胞膜的結構完整性,導致AD 一系列病理變化的產生[31]。 關于Aβ 的硫磺素染色實驗也表明,在AD 早期即9 周齡時,5×FAD 小鼠腦內已出現Aβ 沉積陽性結果并伴有工作記憶的下降,提示淀粉樣斑塊在形成初期即已導致認知功能損傷[32]。 Murakami 等[33]的實驗證明,氧化應激會加速AD 轉基因小鼠Aβ 寡聚體的形成和記憶缺失,而Aβ42突變體能誘導胞內ROS 大量生成并進一步對神經元產生細胞毒性。 在Li 等[1]研究中發現,E22P-Aβ42促進了細胞內 ROS 的生成,說明毒性Aβ42的形成對細胞內ROS 產生起關鍵作用,而且E22P-Aβ42比 Wt-Aβ42更快形成了聚集物的毒性中間體,表明胞漿內自由基過多可直接導致Aβ42的寡聚。 連續兩周對大鼠注射Aβ1-42,會使其腦內海馬、皮質等部位的超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等抗氧化物質生成減少,由此引起大鼠學習能力與記憶功能障礙,表明Aβ1-42能損傷體內抗氧化系統[34]。

另一方面,Aβ 同時在線粒體中起作用。 Fran?a等[35]的實驗分析了氧化應激是淀粉樣蛋白級聯反應的原因還是后果,以及抗氧化防御系統在這一過程中的作用。 體外細胞研究結果表明,Aβ 的存在提高了細胞內氧化水平,誘導了過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和烏頭酸酶等的活性。 Aβ 還改變了耗氧量和復合體III 和IV 的活性,表明Aβ 的毒性機制是通過增加線粒體內ROS 的產生而誘導氧化應激的。 在Aβ 高表達期間,線粒體中的ROS 濃度更高,以維持細胞器內氧化還原平衡,而這種防御系統正是淀粉樣蛋白Aβ 表達過程中維持線粒體完整性的基礎。

在無外界影響的條件下,腦內Aβ 沉積是不可逆的過程。 但最新研究發現,有靶向的抗氧化藥物可能實現這一過程的逆轉,說明氧自由基的代謝過程是一個動態調節過程。

4 抗氧化治療途徑與展望

神經退行性疾病的致病因素大都涉及到氧化應激,目前淀粉樣β 蛋白的毒性和氧化應激是中心假說之一。 抗氧化劑是發揮延遲或抑制底物氧化作用的內源或外源性分子,有清除ROS、抑制ROS生成和內源性抗氧化劑的再生等多種機制[36]。 有證據表明抗氧化劑和自由基清除劑可通過抵抗Aβ誘導的氧化應激和體內外脂質過氧化來保護神經元[37]。 核因子 E2 相關因子 2/血紅素加氧酶-1( nuclear factor erythroid-2-related factor2/heme oxygenase 1,Nrf2/ HO-1)信號通路是一條針對應激環境的多臟器保護通路,該通路通過調控抗氧化劑表達水平及表觀遺傳發揮抗氧化應激作用,可將內源性應激拒于機體外,延緩疾病進展[38]。

NXPZ-2 是一種直接抑制Kelchlike ECH 相關蛋白1(Keap1)-Nrf2 相互作用的化合物,用NXPZ-2 處理注射Aβ 寡聚體建立的小鼠模型,小鼠全細胞裂解產物檢測中Nrf2 上調、核移位增加、靶向抗氧化酶HO-1 和NQO-1 增加,這表明 NXPZ-2 可能是一種很有前途的AD 治療劑,并支持Keap1-Nrf2 相互作用作為AD 中Nrf2 重新激活的有效靶點[39]。 p53凋亡刺激蛋白抑制因子(iASPP)的減少與APP/PS1轉基因小鼠腦組織對氧化應激的易感性有關。 抗氧化劑紫丁香素的處理導致iASPP 上調,iASPP 與Keap1 的相互作用增加,其介導的Nrf2 核轉位可通過iASPP/Nrf2 軸促進Nrf2 下游基因的激活,恢復細胞的氧化還原平衡[40]。

總之,氧化應激反應與AD、Aβ 沉積之間有著密切的關系。 近年來的諸多實驗結論均可表明:具有清除活性氧和抑制氧化酶活性功能的物質都可以用來緩解因Aβ 毒性誘導的神經元細胞損傷。 今后,對于氧化應激、Aβ 與AD 之間的關系進行深層次的研究是非常必要的,不論是對闡明阿爾茨海默病發病機理,還是對尋找預防策略及治療方案都有著非常重要的意義。