局部進(jìn)展期直腸癌PARP-1表達(dá)與臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系

謝旭赟 錢莉文 劉海 孫曉南

術(shù)前放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)是局部進(jìn)展期直腸癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段，雖然能降低腫瘤局部復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]，但仍有22%的患者5年內(nèi)發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。早期識別局部進(jìn)展期直腸癌患者的臨床轉(zhuǎn)歸，有助于發(fā)現(xiàn)高危患者并采取積極的治療措施，改善臨床預(yù)后。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly（ADP-ribose）polymerase-1,PARP-1]是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中具有重要生理功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，少量存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[3]。當(dāng)細(xì)胞核DNA損傷或形成缺口時(shí)，PARP-1激活，而活化的PARP-1識別并結(jié)合DNA缺口，形成同型二聚體，催化尼克酰二核苷酸（NAD+）降解為煙酸和腺苷二磷酸（ADP），通過對受體蛋白的聚腺苷二磷酸糖基化的修飾作用及自身修飾和聚腺苷二磷酸糖基水解酶的作用，傳遞細(xì)胞受損程度，啟動DNA修復(fù)系統(tǒng)，從而有效地修復(fù)DNA損傷[4]。在多種腫瘤中，PARP-1高表達(dá)提示患者預(yù)后較差。因此，本文就局部進(jìn)展期直腸癌PARP-1表達(dá)與臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年1月至2012年11月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院收治的中低位局部進(jìn)展期直腸癌患者50例，其中男35例，女15例；年齡61（43，80）歲；腫瘤位置：中位 20例，低位 30例；癌胚抗原≥5μg/L 23例，＜5μg/L 27例；放療劑量 46.0（43.2，50.0）Gy；單藥化療 6 例，雙藥化療 42 例；術(shù)前新輔助放化療結(jié)束至手術(shù)時(shí)間8（4，12）周；術(shù)前新輔助放化療結(jié)束至手術(shù)期間化療周期：0個周期4例，1個周期30例，2個周期15例，3個周期1例；術(shù)后病理完全反應(yīng)10例，無病理完全反應(yīng)40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)腸鏡病理檢查確診為直腸癌；（2）盆腔增強(qiáng)MRI檢查及全身評估檢查提示局部進(jìn)展期且無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）接受術(shù)前新輔助放化療+全直腸系膜切除術(shù)+術(shù)后輔助化療。

1.2 隨訪情況 術(shù)后采取電話及門診復(fù)查的隨訪方式，術(shù)后前3個月每月1次，之后每3個月1次隨訪患者的一般情況、副反應(yīng)等，完善血常規(guī)、腫瘤標(biāo)志物及盆腔MRI、胸部+上腹部CT等檢查。截至2017年12月31日，中位隨訪時(shí)間為47.85個月。

1.3 PARP-1表達(dá)檢測 采用免疫組化SP染色法。取患者治療前腸鏡活檢腫瘤組織標(biāo)本，脫水后用石蠟包埋制成切片（4μm厚），采用SP法檢測PARP-1的表達(dá)水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。由1位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在光鏡下觀察，每個視野計(jì)數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，每張切片觀察5個視野。細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞即陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞占比=5個視野陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)總和/500×100%，若＞60%為高表達(dá)，≤60%為低表達(dá)。單克隆抗體PARP-1購自美國Cell Signaling Technology公司，以陽性切片為對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計(jì)算生存率，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體生存復(fù)發(fā)情況 50例患者中，13例發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率為26.0%。中位無病生存期為46.75個月，1、3、5 年無病生存率分別為 94.0%、78.5%、62.1%，見圖 1a；1、3、5年總體生存率為 98.0%、93.5%、90.6%，見圖 1b。

圖1 局部進(jìn)展期直腸癌患者的生存曲線（a：無病生存率；b：總體生存率）

2.2 PARP-1表達(dá)檢測結(jié)果 50例患者治療前腫瘤組織中PARP-1高表達(dá)24例，見圖2a；低表達(dá)26例，見圖2b。

圖2 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）高、低表達(dá)的免疫組化SP染色結(jié)果（a：高表達(dá)，陽性細(xì)胞占比＞90%；b：低表達(dá)，陽性細(xì)胞占比30%；×40）

2.3 PARP-1高、低表達(dá)患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及生存情況術(shù)后隨訪期間，PARP-1高表達(dá)組發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)11例（22.0%），低表達(dá)組發(fā)生轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)2例（4.0%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高、低表達(dá)組 1、2、3、4年無病生存率分別為87.5%、64.5%、55.3%、50.2%和100%、98.0%、98.0%、98.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 3。

圖3 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）高、低表達(dá)患者的生存曲線

3 討論

直腸癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率很高[5]。隨著直腸癌治療方法的不斷深入研究，術(shù)前放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)已成為標(biāo)準(zhǔn)治療手段，且較單純手術(shù)治療的生存獲益更好[6]。另有Meta分析結(jié)果顯示，直腸癌尤其是DUCKSⅡ、Ⅲ期患者，術(shù)前放化療聯(lián)合根治性切除術(shù)后復(fù)發(fā)率較直接手術(shù)治療更低[7-8]。然而，在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，直腸癌術(shù)前放化療的效果個體差異較大，腫瘤對放化療的反應(yīng)從完全緩解到完全抵抗均有存在。因此，尋找術(shù)前放化療敏感性相關(guān)因素或靈敏的預(yù)測指標(biāo)等，有助于指導(dǎo)直腸癌患者個體化治療方案的選擇，提高療效，避免無效或過度治療。

放療引起的DNA損傷修復(fù)幾乎在所有腫瘤細(xì)胞株中均可被發(fā)現(xiàn)，且與臨床放射敏感性相關(guān)。也就是說，較難被治愈的腫瘤常常表現(xiàn)出較強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力。2015年，托馬斯·林達(dá)爾提出了“堿基切除修復(fù)”機(jī)制，現(xiàn)已成為DNA損傷修復(fù)機(jī)制的共識。PARP密切參與DNA單鏈損傷（SSB）和雙鏈損傷（DSB）的堿基切除修復(fù)，其中PARP-1占聚腺苷二磷酸糖聚合酶家族中酶活性的90%以上[9]，因此筆者推測PARP-1有望成為評估直腸癌患者臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物。當(dāng)DNA發(fā)生斷裂損傷時(shí)，PARP-1上的鋅指結(jié)構(gòu)會直接結(jié)合到SSB進(jìn)行DNA缺口的識別，并通過鋅Ⅲ活化形成同型二聚體。從而催化NAD+降解為煙酸和ADP，再以ADP為底物在受體蛋白上合成蛋白酶激活受體，調(diào)整其構(gòu)象、穩(wěn)定性和活性[10]。另一方面，PARP-1自帶大量負(fù)電荷，又可招募并活化相關(guān)修復(fù)蛋白，如X線修復(fù)交叉互補(bǔ)組合-1（XRCC1）、DNA連接酶Ⅲ和 DNA聚合酶β，從而參與到DSB修復(fù)過程中[11]。Mazzotta等[12]采用免疫組化法檢測114例乳腺癌患者PARP-1和乳腺癌易感基因1（BRCA1）蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PARP-1高表達(dá)與無病生存期和總生存期相關(guān)，可作為乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。Xie等[13]采用免疫組化法檢測111例術(shù)后接受鉑類藥物輔助化療的非小細(xì)胞肺癌患者核苷酸剪切修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1）、Muts同種組織蛋白2（MSH2）和PARP-1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERCC1和PARP-1陰性患者較ERCC1或PARP-1陽性患者的總生存期明顯延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Liu等[14]對564例胃癌患者腫瘤組織中PAPR-1表達(dá)進(jìn)行免疫組化檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中PARP-1高表達(dá)與幽門螺桿菌感染、腫瘤分化差、腫瘤浸潤深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；PARP-1高表達(dá)患者總生存率及無病生存率明顯降低；提示PARP-1高表達(dá)是胃癌，特別是幽門螺桿菌陽性的胃癌患者預(yù)后不良的重要預(yù)測指標(biāo)。目前有研究發(fā)現(xiàn)PARP-1抑制劑對BRCA1/2突變的乳腺癌及卵巢癌細(xì)胞有明顯抑制作用，并具有放化療增敏作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，PARP-1高表達(dá)組術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率明顯高于低表達(dá)組，1、2、3、4年無病生存率明顯低于低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，治療前PARP-1高表達(dá)，提示局部進(jìn)展期直腸癌標(biāo)準(zhǔn)治療后臨床轉(zhuǎn)歸較差。