大腸桿菌表達病毒樣顆粒的研究進展①

李生軍 張海霞 馮若飛 （西北民族大學生物醫學研究中心，蘭州730030）

自1796年預防天花的牛痘疫苗誕生以來，疫苗至今已有200 余年的發展歷史，其研制與應用是上世紀公共衛生領域最偉大的成就之一［1］。疫苗是用于預防、控制傳染病的發生和流行的一類生物制劑，同時也是遏制甚至是消滅傳染病最有效的方法［2］。目前，傳統技術生產的疫苗大多是減毒疫苗或滅活疫苗，但是這兩種疫苗都可能存在毒力殘余和恢復等安全問題［3］。在20世紀70年代，科學家發現病毒來源的關鍵蛋白可作為用來研制疫苗的抗原，伴隨著現代生物學迅猛的發展，重組亞單位疫苗開始蓬勃發展［4-5］。

作為一種新型亞單位疫苗，病毒樣顆粒（virus like-particles，VLPs）以它獨特的優勢及良好的安全性，成為一種應用前景廣闊的疫苗替代物。VLPs由一種或多種結構蛋白組裝而成，形態和結構與天然病毒相似，但不含病毒的遺傳物質，據大量研究結果表明VLPs具有高免疫活性，并證實了觸發B細胞活化和高滴度抗體的產生與VLPs 的結構和表面密集重復的氨基酸（AA）基序密切相關［6-7］。由于VLPs具有對稱且高度重復的AA 結構，即使在沒有常用佐劑的情況下，也能誘導較強的體液和細胞免疫反應［8］。

目前用于生產VLPs 的平臺以桿狀病毒和大腸桿菌表達系統為主，其中大腸桿菌作為VLPs表達的首選宿主菌，具有細胞生長快速、培養周期短、分子操作簡易、表達量高和在低廉的培養基中快速繁殖等優勢，這也使得VLPs 的表達易于規模化，成為VLPs 構建的首選表達系統［9-11］。本文將基于大腸桿菌表達VLPs及其組裝、表位結構特征和臨床試驗結果等研究進展進行綜述。

1 DNA病毒VLPs

1.1 單鏈DNA病毒VLPs研究進展

1.1.1 豬圓環病毒2 型VLPs 豬圓環病毒2 型（porcine circovirus type 2，PCV2）是一類無囊膜的單股環狀DNA病毒，病毒粒子大小約為17 nm，呈二十面體對稱，是迄今為止發現的最小的動物病毒之一［12］。2009 年我國引進了德國由桿狀病毒生產的亞單位疫苗［13］。此外，國內首個由普萊柯生物工程股份有限公司采用大腸桿菌表達組裝的VLPs 疫苗已于2017 年成功上市，為PCV2 疾病的防控帶來了福音［14］。2018 年 LI 等［15］利用 FMDV 中和 B 細胞表位區代替PCV2-Cap 蛋白的第123～151 和第169～194 氨基酸，經大腸桿菌表達后在體外成功組裝成VLPs，免疫實驗結果表明，Capfb-VLPs 可誘導小鼠和豚鼠同時產生抗PCV2b 和抗FMDV 抗體反應，而不誘導抗誘騙表位抗體。2019 年 DING 等［16］以甲型流感病毒（IAV）M2e 蛋白連接至PCV Cap 蛋白C 末端，成功制備 Cap-M2e VLPs，該 VLPs 對 IAV 和 PCV的攻擊有雙重保護作用。2019 年 WANG 等［17］利用已知的 PCV2-Cap 晶體結構（PDB 登錄號：3R0R）在85G-86S 之間插入 PPV B 細胞表位 B5-E1（228QQIT?DA233），將該基因序列克隆到pET100 載體并表達，成功獲得VLPs，并能誘導小鼠和豚鼠同時產生抗PCV和PPV抗體。

1.1.2 豬細小病毒VLPs 豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）為單股線狀DNA 病毒，病毒粒子直徑約為20～23 nm，無囊膜［18-19］。PPV 感染后主要引起母豬繁殖障礙性疾病，目前尚無有效的治療方法，仍采用疫苗免疫進行預防控制。國外多使用弱毒疫苗，而我國普遍使用滅活疫苗［20］。JI 等［21］報道了一種PPV VP2 蛋白與伴侶分子共表達形成的VLPs，其大小、形狀與天然病毒相似，用該VLPs 免疫小鼠和豚鼠，可誘導產生中和抗體和HI 抗體反應，并顯著降低了病毒攻擊后豚鼠脾臟中PPV 的含量。蔣春英等［22］在 PPV VP2 基因 5'端連接日本腦炎病毒（JEV）中編碼B細胞和T細胞的表位序列，成功獲得連接JEV 多表位肽的PPV VLPs。利用BALB/c 小鼠評價VLPs 的免疫原性，結果表明該VLPs 不但能夠誘導機體產生PPV 特異性的中和抗體，且中和抗體水平與PPV 滅活疫苗產生的中和抗體水平沒有顯著差異。宋品等［23］選用PPV 結構蛋白 VP2，成功在體外組裝 VLPs。陳玉梅等［24］針對PPV VP2 構建原核表達載體，在伴侶分子協同作用下，表達的VP2 蛋白成功在體外組裝成VLPs，動物實驗證實，VLPs可刺激小鼠產生高滴度的中和抗體。

1.1.3 犬細小病毒（canine parvovirus，CPV）VLPs CPV為單股線性DNA病毒［25］。目前，CPV疫苗主要有滅活苗和弱毒苗，但是不能有效預防CPV多個分型的感染，基于此，NAN等［26］構建了CPV VP2原核表達載體，并在伴侶分子pTf16協同作用下，在體外組裝得到CPV VLPs。免疫原性評價結果顯示，該VLPs可使免疫后豚鼠產生高效價的HI抗體和中和抗體。XU等［27］構建了pSMK VP2并表達，成功獲得組裝的VLPs，免疫小鼠后可刺激機體產生良好的體液免疫和細胞免疫反應。

1.1.4 人細小病毒VLPs 人細小病毒（human par?vovirus B19，HPV B19），簡稱B19 病毒，為單股線性DNA病毒，無囊膜。B19主要通過呼吸和母嬰傳播，且感染后的臨床癥狀比較復雜［28］。SANDRA 等［29］采用原核表達系統成功在體外構建以VP2 蛋白為基礎的VLPs，并對組裝條件進行了優化，使其組裝的VLPs 最接近病毒粒子的天然構象。ARELI 等［30］在B19 衣殼蛋白VP2 的第71～72 堿基之間插入人類呼吸道合胞病毒F 蛋白的第215～278 堿基，并定向克隆至pET22b中進行誘導表達，表達的重組蛋白分離純化后在酸性條件下能體外自組裝成VLPs。

1.2 雙鏈DNA病毒VLPs研究進展

1.2.1 人類乳頭瘤病毒VLPs 人類乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）為閉合環狀雙鏈DNA病毒，無包膜，有8 個開放閱讀框，編碼6 個早期蛋白和2個晚期蛋白（L1、L2），電鏡下天然的病毒粒子呈二十面對稱。該病毒與口腔癌、肛門癌、陰道癌、外陰癌、陰莖癌有著高度的相關性［31］。目前獲批上市的疫苗有HPV16/18/6/11 四價苗Gardasil?和HPV16/18 二價苗 Cervarix?［32-33］。目前，針對 HPV VLPs 疫苗也有相關研究，謝明輝等［34］通過擴增HPV18 的L1 基因，并采用大腸桿菌表達，成功獲得組裝的VLPs。用該HPV VLPs 接種山羊和兔后，檢測中和抗體，實驗結果表明中和抗體滴度較高。魏旻希等［35］通過擴增 HPV16 L1 基因，并構建 pTO-T7-L1 重組載體，可成功誘導表達HPV16 L1 蛋白并在體外裝配為直徑 50 nm 的 VLPs。楊春燕等［36］根據GenBank 數據庫AF335603.1序列合成HPV11-L1全長基因，構建表達載體pTO-T7-HPV11-L1，誘導表達的重組蛋白在體外成功組裝成HPV11 VLPs 且組裝效率達到100%，免疫小鼠后中和抗體滴度可達106。

1.2.2 乙肝病毒 根據疾病控制與預防中心（CDC）的數據顯示，全球約有2.4 億乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）攜帶者，與感染的成人相比，新生兒中HBV 感染很難被清除，尤其是圍生期感染的兒童，其中有90%會演變為慢性感染，現有的乙肝疫苗對于慢性感染并不奏效，并且HBV 感染后引起的免疫耐受是研制治療性疫苗的最大障礙［37-39］。基于此，乙肝新型疫苗的研制迫在眉睫。WHITA?CRE 等［40］將 HBV PreS1 特異性中和 B 細胞表位插入到能增強多價抗體產生的變異WHcAg上，成功表達PreS1-WHc-VLPs，研究結果表明，用PreS1-WHc-VLPs 免疫HBV-Tg 免疫耐受小鼠和野生型小鼠后，可誘導兩種小鼠產生滴度水平相當的抗PreS1 特異性中和抗體；此外，將PreS1 特異性中和抗體注射到乙型肝炎小鼠中可預防急性感染，并能清除先前感染HBV 小鼠血清中的HBV；在T 細胞水平，PreS1-WHc-VLPs 刺激 HBcAg 特異性 CD4+/CD8+T 細胞，以清除細胞內的HBV并防止cccDNA的積累。

上述 DNA 病毒 VLPs 研究結果發現，在 VLPs 構建過程主要由病毒的一種或多種結構蛋白自組裝成不含遺傳物質的空心衣殼，因此病毒無法復制和增殖，同樣不具備感染致病的能力。此外，衣殼蛋白作為抗原決定簇的重要組成部分，不僅可以刺激機體產生中和抗體，而且與病毒的復制等過程密切相關，如：研究發現PCV2 的Cap 蛋白與病毒的毒力以及復制有密切的關系［41］；CPV 的 VP2 蛋白與病毒的感染與復制有關［42］；B19 的 VP1 和 VP2 在病毒復制以及病毒DNA 入核等過程發揮著重要的作用［30］；HPV 衣殼蛋白L1 參與病毒的入侵以及包裝過程等［43］。

2 RNA病毒VLPs研究進展

2.1 口蹄疫病毒VLPs 口蹄疫病毒（foot-andmouth disease virus，FMDV）屬于無囊膜的正鏈RNA病毒，主要引起的偶蹄類動物的急性、熱性、高度傳染性疾病［44-45］。目前我國主要采用 O、A 與 Asia1 型口蹄疫三價高效滅活疫苗對口蹄疫進行防控，但是疫苗價格相對較高。近年來，FMDV 病毒樣顆粒疫苗的研究取得了較大進展，GUO 等［45］通過改造載體構建了 pSMK-VP0、pSMA-VP1、pSMC-VP3 等三種質粒，并共轉入大腸桿菌后成功表達VP0、VP1、VP3蛋白，這三種蛋白在體外可自裝成與天然病毒顆粒樣結構相似的VLPs，利用PD50測試評估VLPs 疫苗效價顯示FMD VLPs 組疫苗效力可達每劑6.34 PD50。XIAO 等［46］以 FMDV Asia1 為模板，擴增含有核糖體結合位點（ribosome binding site，RBS）的RBS-VP0、RBS-VP1、RBS-VP3，并克隆至pET28b 誘導表達，表達產物在體外成功組裝成VLPs，該VLPs 與佐劑乳化后接種實驗牛，可持續6 個月產生FMDV 特異性抗體，疫苗效力可達到 11.75 PD50/劑。LEE 等［47］通過載體改造并分別構建了表達載體pHD-Amp-VP0VP3、pHD-Kan-VP1，兩種質粒共同轉化至BL21誘導表達，表達產物可成功在體外組裝成FMDV VLPs。董虎等［48］以南非2型FMDV 為模板構建重組質粒pSMK-VP0VP3 和pSMK-VP0，并同時轉入大腸桿菌 BL21 后成功誘導表達 VP0、VP1、VP3 蛋白，純化后經電鏡分析在體外成功組裝成VLPs。

2.2 戊型肝炎病毒VLPs 戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）基因組為線性單股正鏈的RNA，長約7.2 kb，包含3 個開放讀碼框架，其中ORF2 主要編碼結構蛋白。據不完全統計，全球有近三分之一的人口受到HEV 的威脅，防控該病最有效的方法就是免疫接種［49］。目前，有 2 個 HEV 疫苗已進入臨床試驗階段，分別是rHEV 和p179疫苗，而全球唯一商品化的HEV 疫苗則是由廈門大學和廈門萬泰滄海生物技術有限公司聯合研制的HEV VLPs 疫苗，該疫苗利用大腸桿菌表達HEV 的ORF2 片段制備，并進行了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期臨床試驗，已于2012年批準上市［50］。盡管如此，研究人員對HEV 的研究還在不斷地深入，IM 和 GE 等［51-52］發現 HEV 結構蛋白中一個位于aa 394~aa 606 的多肽E2 能保護恒河猴免受HEV 病毒的感染。LI 等［53］將 E2 蛋白 N 端的 26 個氨基酸延伸至aa 368位置在大腸桿菌中表達重組蛋白p239，成功形成 VLPs，動物實驗證實 p239 VLPs 具有良好的免疫原性和免疫保護性。

2.3 流感病毒VLPs 流感病毒是單股負鏈RNA病毒，該病毒由空氣傳播，且傳播速度快，人感染后主要引起嚴重的呼吸系統疾病，死亡率約為30%［54］。流感病毒基因組由8 個節段組成，由于其RNA 聚合酶不具備糾錯功能，所以病毒極易發生變異，以逃避機體免疫。有研究表明H3 亞型流感病毒HA 的高度保守長α 螺旋區域（LAH）的76~133 aa可以誘導小鼠產生中和抗體［55］。基于以上研究，ZHENG 等［56］分別從 Sh2/H7N9 HA 基因和乙肝病毒基因中擴增出LAH基因和HBc基因，并將LAH插入到HBc 基因片段中，在體外組裝成30 nm 大小的VLPs，動物實驗表明，制備的LAH-HBc-VLPs 疫苗與佐劑乳化后能使小鼠免受同源病毒（H7N9）和異源病毒（H1N1和H3N2）的攻擊。

2.4 豬流行性腹瀉病毒VLPs 豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于單股正鏈 RNA 病毒［57］。針對 PEDV 重組疫苗的研究主要集中在纖突蛋白S上，有研究表明S蛋白上存在3個B 細胞表位，膜糖蛋白M 上也存在一個B 細胞表位［58］。2017 年 FRANK GILLAM 在 HBc 的 79～88 aa之間分別插入上述四個B 細胞表位，此外將4 個B細胞表位依照S1-S2-M 的順序插入至HBc 相同的位置，經大腸桿菌誘導表達后的蛋白均能組裝成直徑為 30～40 nm 的 VLPs。用 VLPs 免疫 BALB/c 小鼠，結果顯示，不管是單個表位VLPs免疫組還是多表位VLPs 免疫組，血清和糞便中的IgG 和IgA 隨著免疫劑量的增高而增高。病毒中和抗體實驗結果顯示，只有S1表位的VLPs 和S1-S2-M 表位的VLPs 能夠誘導機體產生中和抗體，且兩者中和抗體滴度沒有明顯的差異［59］。

2.5 西尼羅河病毒VLPs 西尼河病毒（West Nile Virus，WNV）基因組為單股正鏈 RNA 病毒，基因組包括一個開放閱讀框，編碼核衣殼蛋白（C）、跨膜蛋白（PrM）和囊膜蛋白（E），該病毒主要引起馬、鳥類和人類致死性腦炎［60］。SPOHN 等［61］通過擴增 WNV E 蛋白的結構域Ⅲ，并將目的基因克隆到表達載體pET42T，該重組質粒轉化至大腸桿菌BL21，經誘導表達后可在體外自組裝成WNV VLPs。WNV 攻毒實驗結果表明，單次注射WNV VLPs 疫苗就足以在小鼠體內誘導產生大量的中和抗體，即使在沒有任何佐劑的情況下，注射三次WNV VLPs 疫苗也完全可以保護小鼠免受致命的WNV攻擊。

2.6 豬繁殖與呼吸綜合征病毒VLPs 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus ，PRRSV）為單股正鏈 RNA 病毒，主要引起感染豬發熱、母豬流產、早產、產死胎等［62］。MURTHY 等［63］以 HBV 為載體，在其核心抗原（HB?cAg）的第78~79氨基酸之間插入PPRSV的B細胞和T細胞表位，并克隆至原核表達載體pET28a，誘導表達后的蛋白在體外自組裝成HBcAg VLPs；實驗結果表明，HBcAg VLPs 不僅能有效阻斷PPRSV 對敏感細胞MARC 145 的感染，而且還能引起強烈的B 細胞和T細胞反應。曹佳媛等［64］同樣以HBc為載體表達PRRSV 保護性抗原GP5，成功構建HBc-GP5 表位VLPs，利用小鼠進行免疫原性評價，結果顯示，HBc-GP5 VLPs 能夠有效提呈GP5 并誘導機體產生體液和細胞免疫。

2.7 輪狀病毒VLPs 輪狀病毒（rotavirus，RV）是引起0～5 歲兒童急性胃腸炎的主要病原，為雙鏈RNA 病毒［65］。目前國內上市的 RV 疫苗主要是單價Rotarix 疫苗和五價Rotateq 疫苗。針對RV VLPs 的研究主要集中在桿狀病毒表達系統，但常樂等［66］通過將RV 的NSP3 基因片段插入到原核表達質粒pA?CYC-MS2 T7 啟動子下游，構建的 pACYC-MS2-NSP3 表達載體可在大腸桿菌中成功表達含RV NSP3 基因的VLPs，溫度穩定性研究結果表明，該VLPs 在不同溫度下均能放置10 d 仍保持穩定，為VLPs疫苗在運送、保存等過程提供了質量保證。

2.8 其他RNA 病毒VLPs 近幾年爆發的新型RNA 病毒嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respira?tory syndrome，SARS）、中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）等給世界衛生安全帶來了不可估量的損失，針對這些病毒的大腸桿菌表達VLPs疫苗的研究相對較少，但有在其他表達系統中研究的報道。

SARS 以高病死嚴重威脅著人類健康，VLPs 疫苗以其較好的安全性和良好的免疫原性成為該病毒最有潛力的候選疫苗。KHAN 等［67］用桿狀病毒表達系統同時表達SARS 的M 蛋白、E 蛋白及3a 蛋白，在昆蟲細胞內能組裝成類似于SARS 病毒粒子的球形VLPs。LU 等［68］同樣以桿狀病毒表達系統同時表達M 蛋白、E 蛋白和S 蛋白，研究發現此種組裝搭配不僅能提高VLPs的組裝效率，而且能使其分泌型表達。LIU 等［69］將 SARS 的 S 蛋白和流感病毒 M1 蛋白利用桿狀病毒表達系統同時表達，組裝成嵌合型S/M1 VLPs，免疫小鼠后可誘導產生S蛋白特異的免疫應答。

中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respira?tory syndrome coronavirus，MERS-CoV）于 2012 年首次分離，是一種病死率達35%以上致死性冠狀病毒。目前尚無獲批的MERS-CoV預防性疫苗。王翀等［70］將 MERS-CoV 纖突蛋白 S、膜蛋白 M 和包膜蛋白E 基因重組至桿狀病毒表達載體，將共表達S、M和E基因重組桿狀病毒感染Sf9細胞，培養后的細胞上清液經蔗糖梯度密度離心后，得到MERS-CoV VLPs，動物實驗評價MERS-CoV VLPs的免疫原性較好，表明MERS-CoV 嵌合型VLPs具有開發成為其疫苗候選株的潛能。

上述 RNA 病毒 VLPs 研究結果表明，VLPs 不僅可以誘導有效而廣泛的免疫應答，而且易于被樹突狀細胞識別，其抗原成分經加工處理后遞呈MHCⅡ類分子，促使樹突狀細胞的成熟和遷移。此外，VLPs不僅可以通過交叉提呈的方式經MHC Ⅰ類分子遞呈，活化CD8+T 細胞，實現由CD8+介導的保護性免疫應答，而且也可作為自身佐劑，即使沒有免疫佐劑的情況下，VLPs也能誘導很強的體液和細胞免疫［71］。就目前VLPs 的研究進展來看，構建VLPs主要集中在無囊膜病毒中，包膜病毒VLPs由于其形狀和結構極不規則，所以通常無法在實驗中確切的模擬天然病毒結構。

3 問題與展望

迄今為止，不同表達系統來源的病毒樣顆粒在各實驗室成功制備，但只有極少數的能在疫苗應用中取得突破性進展，制備工藝、組裝工藝等是限制病毒樣顆粒疫苗發展的重要原因。雖然大腸桿菌表達系統由于具有低成本、安全性好、操作簡單、高表達、生產周期短等優點而被廣泛應用于生物醫藥領域，但在制備和組裝結構復雜的病毒樣顆粒方面仍然存在諸多問題。①許多病毒迫于免疫系統的壓力發生抗原變異，因此VLPs不能針對變異抗原產生持久的免疫應答。②VLPs 在基礎研究中的預防性疫苗主要針對單個血清型，不能起到預防其他血清型病毒攻擊作用。③組裝VLPs 的蛋白有時不止一種，因此組裝成VLPs的概率很小。④由于大腸桿菌細胞質是偏還原性的環境，因此蛋白質容易形成錯配的二硫鍵，導致異源蛋白形成包涵體［72］。⑤大腸桿菌來源的蛋白純化時與其是否可溶密切相關，可溶性蛋白在純化過程中不僅省去了繁瑣的變性與復性，也減少了有效分子的損失，所以很多人開始從表達載體以及伴侶分子共表達系統著手，實現目標蛋白可溶性以及使純化過程由繁至簡。桿狀病毒表達系統包裝的VLPs雖然不存在變性與復性，但是VLPs 與桿狀病毒芽生型病毒粒子類似，所以在后期使用密度梯度離心進行純化時操作繁瑣［73］。⑥內毒素的去除，由于生產過程中工藝條件的變化及抗生素的使用等，會使部分大腸桿菌死亡或分解，此時會釋放一種脂多糖稱為內毒素。由于機體對內毒素有免疫識別作用，因此大腸桿菌來源的生物制劑必須進行徹底純化，去除產生的內毒素使其達到藥品中規定的含量后方可使用［74］。目前報道去除內毒素方法主要有超濾法、活性炭吸附法、親和吸附法、離子交換層析等。其中超濾法和活性炭吸附法由于對目標分子是非特異性選擇，所以會導致有效分子流失［74-75］；活性炭吸附法在樣品處理后活性炭不易除去，影響產品的后續使用；而親和吸附法和離子交換層析對制劑中的內毒素有高度的特異性與選擇性，相較而言，在目標蛋白損失最小的情況下，能更有效地去除制劑中的內毒素［76］；此外，有研究表明內毒素的重要組成部分脂質A 可刺激 TLR4/MD-2/CD14 以及 caspase-11 等通路，從而產生免疫炎癥反應［77］。因此，LIU 等［78］通過基因工程的方法減少脂質A 的脂肪酸鏈并去除1'-磷酸基團，從而最大限度地降低內毒素毒性，表達具有低內毒素活性的蛋白質。盡管存在諸多不足，但是可以通過目的基因優化入手，同時進行大腸桿菌外源表達調控基因改造以及多種內毒素去除方法的結合等來解決以上問題。

總之，人工構建的VLPs 作為一種新興的技術，在病毒的預防、治療以及診斷方面具有廣闊的前景，相信大腸桿菌表達系統和最接近免疫功能的病毒樣顆粒相結合，會帶給我們一個疫苗研發全新的開始。