CD4+T細(xì)胞在孕早期母胎界面免疫耐受中的研究進展①

孫 蘭 康曉敏 武 澤（昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，昆明650032）

母胎界面主要由來自母體蛻膜免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞以及胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞構(gòu)成。滋養(yǎng)層細(xì)胞攜帶父系HLA-G抗原，與母體直接接觸，極易引發(fā)母體免疫反應(yīng)。而蛻膜免疫細(xì)胞在母體免疫反應(yīng)中同時發(fā)揮免疫促進和抑制功能，基質(zhì)細(xì)胞分泌活性分子發(fā)揮功能。這三類細(xì)胞在妊娠期間相互作用，使母體保持對胎兒的免疫耐受。CD4+T細(xì)胞是蛻膜免疫細(xì)胞的主要類群之一，也是成功妊娠的保證。母胎界面的CD4+T細(xì)胞經(jīng)抗原刺激后根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子分為Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh，本文就該類群在母胎免疫耐受中的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 CD4+T細(xì)胞起源、分化和功能特點

人體幼稚CD4+T細(xì)胞（naive CD4+T cells）主要由骨髓來源的多能干細(xì)胞遷移至胸腺后分化、成熟為初始CD4+T細(xì)胞，遇到抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cells，APCs）提呈的抗原或相應(yīng)細(xì)胞因子刺激時，進一步分化為輔助性T細(xì)胞（helper T cells，Th，主要包括Th1、Th2、Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T，Treg）和濾泡輔助T細(xì)胞（follicular helper cells，Tfh）等。

Th1的活化主要受IFN-γ和IL-2激活，同時分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和TNF-β等炎癥因子，參與細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)、排斥反應(yīng)等；IL-4激活Th2分泌IL-4、IL-6、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），參與體液免疫，能夠促進IgE和IgG1抗體的產(chǎn)生和嗜酸性粒細(xì)胞的生長和分化，并且抑制多種巨噬細(xì)胞的功能［1］；Th17在低濃度TGFβ和IL-6、IL-23等的共同參與下活化，產(chǎn)生的IL-17、IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，抑制Treg細(xì)胞活性，加強機體免疫應(yīng)答和病原體感染和排斥反應(yīng)；高濃度的TGF-β則刺激Treg活化，產(chǎn)生的IL-10、TGF-β免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子促進免疫耐受；Tfh是2000年SCHAERLI等［2］新發(fā)現(xiàn)的存在于外周免疫器官淋巴濾泡中的一類由幼稚輔助CD4+T細(xì)胞經(jīng)IL-6、IL-21刺激分化形成的Th，特異性表達(dá)趨化因子受體5（CXCchemokine receptor 5，CXCR5）、誘導(dǎo)型共刺激分子（inducible synergistic co-stimulation molecules，ICOS）、程序性細(xì)胞死亡因子1（programmed death 1，PD-1）、CD40配體，主要分泌IL-21和IL-6因子，Tfh參與B細(xì)胞的成熟、分化、遷移和成活，是T細(xì)胞依賴B細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵［3-5］。

CD4+T細(xì)胞的分化除了受多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)控制外，特異性“主”轉(zhuǎn)錄因子起主要作用：Th1特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4），參與Th2分化的主要轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和STAT6，而Th17則特異性表達(dá)RORγt，在Tfh細(xì)胞的發(fā)育和分化中，轉(zhuǎn)錄因子B細(xì)胞淋巴瘤蛋白6（Bcell lymphoma 6 protein，Bcl-6）轉(zhuǎn)錄因子起主要作用［6］。Treg的主轉(zhuǎn)錄因子為Foxp3，各類型的CD4+T細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子構(gòu)成復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，在母胎免疫耐受中發(fā)揮作用［7］。

2 CD4+T細(xì)胞與妊娠界面免疫耐受的關(guān)系

妊娠早期在整個妊娠周期中占據(jù)重要地位，該時期涉及受精、胚胎著床、母胎免疫平衡建立等一系列生理過程。任何過程出現(xiàn)問題都會導(dǎo)致受精或著床失敗、胚胎發(fā)育不良、早期流產(chǎn)等多種妊娠相關(guān)疾病。

2.1 Th1/Th2平衡與胚胎著床和妊娠維持 Th1/Th2平衡是母胎免疫耐受的主要機制之一，也是維持妊娠免疫微環(huán)境必要因素。正常妊娠時Th1/Th2傾向Th2，它分泌的細(xì)胞因子促進滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長入侵和內(nèi)膜容受性增強。小鼠妊娠模型研究發(fā)現(xiàn)母胎界面呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢，一旦失去這種優(yōu)勢，胚胎丟失率顯著升高［8］。YONEYAMAE、PICCINNI、LI等［9-11］研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）、不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）、子癇前期（preeclampsia，PE）、妊娠高血壓綜合征（pregnancy induced hypertension，PIH）患者的蛻膜組織和外周血樣本中的細(xì)胞因子，顯示Th2細(xì)胞數(shù)量和Th2/Th1明顯低于正常妊娠水平，呈現(xiàn)Th2免疫弱勢［12］。

Th1和Th2型細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子與母胎界面各部分形成相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)，妊娠時表現(xiàn)出Th2型免疫優(yōu)勢。有研究表明，滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的胸腺基質(zhì)促淋巴生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）誘導(dǎo)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（decidual stromal cell，DSCs）大量表達(dá)IL-10和TGF-β，減少Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生（如IFN-γ）；同時，TSLP誘導(dǎo)蛻膜中未成熟的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生Th2型趨化因子CCL-17、CCL-22［13］，從而募集大量Th2細(xì)胞到蛻膜組織，刺激蛻膜組織產(chǎn)生IL-10，抑制TNF-β產(chǎn)生，形成Th2型細(xì)胞優(yōu)勢，保證母胎界面免疫抑制［14］。此外，共刺激信號在T細(xì)胞的活化中發(fā)揮正向或負(fù)向作用，妊娠早期蛻膜CD4+T細(xì)胞表達(dá)抑制性共刺激分子，如PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白素3（Tcell immunoglobulin and mucin domain-3，Tim-3）等，使其優(yōu)先產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子，同時Th2表現(xiàn)出更高的增殖活性，進一步維持母胎界面免疫抑制性，維持正常妊娠［15］。小鼠實驗證實：PD-1和Tim-3聯(lián)合阻斷后，母胎界面表現(xiàn)出CD4+細(xì)胞增殖下降，Th1型細(xì)胞因子增多，母胎界面免疫平衡紊亂，小鼠流產(chǎn)率增高等現(xiàn)象［15］。另外，臨床研究也發(fā)現(xiàn)蛻膜中PD-1+Tim-3+CD4+T細(xì)胞減少，炎癥因子如TNF-α和IFN-γ等出現(xiàn)超生理狀態(tài)的增多［15-16］。研究者發(fā)現(xiàn)用肝素、阿司匹林、環(huán)孢素調(diào)節(jié)全身或局部Th1/Th2細(xì)胞因子平衡后，有效防止了抗磷脂綜合征復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（antiphospholipid syndrome，APS-RSA）或流產(chǎn)傾向患者的流產(chǎn)現(xiàn)象［10］。以上研究說明，母胎界面形成Th2細(xì)胞優(yōu)勢是胚胎著床和成功妊娠重要因素之一。

2.2 Th17/Treg平衡誘導(dǎo)維持母胎免疫耐受 進一步研究發(fā)現(xiàn)生理和病理妊娠均涉及更為復(fù)雜的分子機制，因此提出了Th17/Treg平衡模式［17］。Th17/Treg是隨Th1/Th2之后的又一個相對獨立的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。Th17細(xì)胞主要通過RORγt轉(zhuǎn)錄因子和IL-17家族介導(dǎo)炎癥發(fā)生，它在不同的炎癥組織有不同的表型，表現(xiàn)出比Th1更多表型和生命力［18］。Treg是抑制CD4+T輔助細(xì)胞的一個獨特亞群，參與人類和小鼠對自身和外來抗原的免疫耐受［19-20］。正常妊娠過程中，母胎界面Treg存在大量富集，研究發(fā)現(xiàn)Treg數(shù)量不足和功能缺失時將會導(dǎo)致多種妊娠不良結(jié)果。ALUVIHARE［21］、SHIMAL［22］等的小鼠研究發(fā)現(xiàn)Treg在異基因小鼠胚胎孕早期對母胎免疫耐受的建立起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。同時，臨床研究發(fā)現(xiàn)在URSA和PE患者的母胎界面中Treg數(shù)量明顯減少［23］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胎盤合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生的人絨毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）使CCL-2募集大量Treg進入子宮內(nèi)膜，形成Treg優(yōu)勢，促進母胎界面免疫耐受建立［24］。母胎界面CD4+Treg主要分為3類：CD25HiFOXP3+、PD-1HiIL-10+和TIGIT+FOXP3dim，其中CD25HiFOXP3+Treg的含量最多，且能夠抑制CD8+效應(yīng)T細(xì)胞增殖［25］。SALVANY-CELADES等［25］發(fā)現(xiàn)HLA-G與滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)CD4+CD25-向CD4+CD25+FOXP3+Treg分化，誘導(dǎo)的CD4+CD2 5+FOXP3+Treg又上調(diào)HLA-G的表達(dá)，促進滋養(yǎng)層增殖和侵襲。另外妊娠初期多種共抑制分子PD-1、Tim-3、CTLA-4等誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的Treg，有利于維持母胎免疫耐受阻斷PD1-PDL1后CD25+FOXP3+Treg數(shù)量減少，小鼠妊娠率下降，過繼Treg后，胚胎存活率提高［26］。以上證據(jù)提示，妊娠界面發(fā)揮免疫抑制功能的可能是CD25+FOXP3+Treg。

Th17分泌的IL-17與Treg細(xì)胞共同促進滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和入侵蛻膜組織，這對母胎界面免疫微環(huán)境起著積極的作用［26］。孕早期蛻膜細(xì)胞分泌CCL2募集Th17進入母胎界面，同時滋養(yǎng)層細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)CCL-2、CCL-2R表達(dá)，減少母胎界面Th17的量［27］。另外，妊娠早期母胎界面豐富的Treg也通過旁分泌或直接接觸抑制Th17過度增殖，減少IL-17產(chǎn)生，一旦Treg細(xì)胞數(shù)量減少或功能受損，Th17過量富集引起過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致流產(chǎn)或子癇前期等疾病［28-30］。這些都說明Th17/Treg平衡是Th1/Th2平衡的發(fā)展和補充，也是調(diào)節(jié)母胎免疫微環(huán)境，維持母胎界面免疫平衡的又一關(guān)鍵因素。

2.3 Tfh調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg平衡維持母胎免疫耐受 研究者發(fā)現(xiàn)僅Th1/Th2、Th17/Treg平衡學(xué)說并不能解釋母胎免疫的全部問題，Tfh也在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［31］。Tfh細(xì)胞是CD4+細(xì)胞一個獨特的亞群，表達(dá)趨化因子受體CXCR5和轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6，特異性分泌IL-21，參與生發(fā)中心形成，在B細(xì)胞增殖、分化、類型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時促進自身和Th17的活力。正常妊娠時，母胎界面Tfh存在一定水平增殖，多數(shù)不良妊娠結(jié)局與母胎界面中Tfh異常富集和功能缺失密切相關(guān)［20，31-34］。進一步研究發(fā)現(xiàn)正常妊娠期滋養(yǎng)層細(xì)胞和DSCs大量表達(dá)PD-1，可以控制Tfh細(xì)胞的過度增殖，減少生發(fā)中心和B細(xì)胞的產(chǎn)生，誘導(dǎo)母胎界面耐受建立［31，35］。阻斷PD-1/PD-L1通路后，母胎界面Tfh過量積累，抑制Treg增殖，同時促進Th1和Th17的發(fā)育，母胎界面免疫平衡破壞，進而影響胚胎存活［26，31，35-36］。另外，DSCs分泌大量趨化因子13（CXCL13），募集Tfh進入母胎界面，進而激活B細(xì)胞，介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)，防止外部病原體的入侵［37］。研究者還發(fā)現(xiàn)，妊娠早期外周血中較高水平的雌激素在一定程度促進Tfh增殖，同時IL-10、IL-6、IL-10和IL-21水平升高，激活B細(xì)胞產(chǎn)生抗體啟動體液免疫［38］。前期本課題組通過流式細(xì)胞術(shù)檢測URSA患者子宮和內(nèi)膜的Tfh和B細(xì)胞相關(guān)因子，發(fā)現(xiàn)Tfh與母體B淋巴細(xì)胞活化密切相關(guān)，提示Tfh可能參與抗體產(chǎn)生過程。

以上研究表明，同種異體妊娠中母胎界面各組分可能通過控制Tfh的增殖、分化和凋亡過程進一步調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17、Treg等免疫細(xì)胞的功能，建立免疫耐受，使Th1/Th2、Th17/Treg平衡模式發(fā)展為Th1/Th2/Th17/Treg/Tfh新模式。但母胎界面的Tfh調(diào)節(jié)這些免疫細(xì)胞的具體機制仍需進一步研究。

3 展望

母體的蛻膜細(xì)胞、免疫細(xì)胞和胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞是妊娠界面的主要組成部分，它是母體與胎兒聯(lián)系的樞紐，是免疫學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)研究的前沿課題，此處先天免疫和適應(yīng)性免疫協(xié)同工作，維持正常妊娠。目前研究的熱點主要集中在妊娠界面的主要淋巴細(xì)胞亞群——NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，最近不少研究將關(guān)注點轉(zhuǎn)向母胎界面的CD4+T細(xì)胞。這群細(xì)胞具有獨特的表型，表達(dá)一系列的細(xì)胞因子和細(xì)胞標(biāo)記。同時這群細(xì)胞也受母胎界面特殊微環(huán)境的調(diào)控，表現(xiàn)出對胚胎抗原的特異性，其抑制性受體表達(dá)上調(diào)，妊娠期具有調(diào)節(jié)表型的T細(xì)胞亞群在局部富集并向外周擴增，參與母胎免疫耐受的建立和維持，任意T細(xì)胞亞群數(shù)量異常或功能障礙，都可能導(dǎo)致嚴(yán)重的妊娠結(jié)局。

目前研究證實CD4+T細(xì)胞的分型和在正常妊娠與其他免疫細(xì)胞的一些聯(lián)系，但在妊娠特定的微環(huán)境下，CD4+T細(xì)胞的進一步分型？各個表型有什么功能？它們?nèi)绾芜w移到蛻膜局部？又是如何與B細(xì)胞、NK細(xì)胞以及其他CD4+T細(xì)胞交互作用參與母胎識別和妊娠界面免疫反應(yīng)？這些問題都值得進一步的挖掘和探索。相信隨著對CD4+T細(xì)胞在母胎界面免疫耐受研究的不斷深入，將有望找到以上問題的答案，了解一大部分的CD4+T細(xì)胞的致病機理和一些妊娠期綜合征病因，為相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療提供新的參考。