中性粒細胞外誘捕網與炎癥性腸病關系的研究進展①

馬雪妮 許慧梅 程 龍 楊一蕃 張德奎

（蘭州大學第二醫院消化內科，蘭州 730030）

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是常見的慢性、反復發作性、非特異性胃腸道自身炎癥性疾病，主要包括克羅恩病（Crohn's disease，CD）和潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）［1］。已有的證據表明，基因、環境、免疫等多種因素共同參與IBD 的發病［2-3］。IBD 的主要病理變化是異常的黏膜免疫和炎癥反應，其主要特點包括促炎癥細胞因子、氧自由基、氮的生成及炎癥細胞的激活。其中，中性粒細胞是參與組織炎癥損傷的主要細胞，其在IBD 中的主要機制涉及遷移并聚集在炎癥部位，并釋放炎癥因子及大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）［4-5］。

近年來，國內外學者研究表明：作為一種有別于細胞壞死和凋亡的特殊細胞死亡程序，中性粒細胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）與許多自身免疫/炎癥性疾病［系統性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕關節炎、銀屑病、痛風及小血管炎等］、腫瘤性疾病（肺癌、乳腺癌及結直腸癌等）、創傷愈合（糖尿病患者創傷愈合）、感染性疾病（敗血癥及膿毒癥等）、血栓性疾病（下肢深靜脈血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等）等密切相關［6-13］。而炎癥性腸病作為胃腸道自身炎癥性疾病，其具體發病機制尚未完全闡明。本文重點就NETs 與炎癥性腸病關系的最新研究進展進行綜述，旨在為炎癥性腸病的發病機制和治療方案提供新思路。

1 NETs概述

1996 年，TAKEI 等［7］使用氟波醇（phorbol myristate acetate，PMA）激活中性粒細胞時觀察到，中性粒細胞的分葉核退縮、擴散，染色體解聚，核膜破裂，核內成分釋放到細胞質，細胞膜破裂。同時，BRINKMANN 等［14］在2004 年將該過程中釋放于細胞外的網狀結構正式命名為NETs。隨著后續研究的不斷深入，NETs 被認為是以DNA 為骨架，其間鑲嵌組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、鈣衛蛋白、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、組織蛋白酶G 等顆粒蛋白、蛋白水解酶、抗菌肽及組蛋白等［15］。目前已發現，多種物質能誘導NETs 形成，包括細菌、真菌、原生動物、病毒等在內的病原體和一些化學或生物因素［7，16-19］。中性粒細胞產生NETs的過程被稱為NETosis，目前研究發現，根據刺激物的不同，其主要涉及3種不同模式：①自殺式NETosis：又稱晚期溶解性NETosis，此類NETs的產生起始于中性粒細胞受到PMA 等刺激后通過蛋白激酶C（PKC）激活Raf/MERK/ERK信號轉導通路激活煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，進而刺激ROS 產生，從而組蛋白在肽酰基精氨酸脫亞胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）的作用下向瓜氨酸化組蛋白轉變，形成瓜氨酸化的組蛋白，其中瓜氨酸化的組蛋白H3（citH3）發揮了重要作用，并導致核染色體解聚［20］。該過程僅需2～4 h，并且與凋亡機制不同，其不需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific proteases，Caspase）的參與。此過程主要依賴于ROS的產生及PAD4 介導的核染色體解聚［20］；②細胞核DNA 釋放式NETosis：又稱為早期非溶解性NETosis，Toll 樣受體和補體C3 蛋白等可觸發此種類型的NETosis，釋放NETs 后的中性粒細胞壽命不受影響，且細胞核膜和細胞膜的完整性不被破壞，仍具有運動、趨化、吞噬病原體的能力，此過程約持續5～60 min［15］。但與自殺式NETosis 不同，該過程不依賴于ROS 的產生和Raf/MERK/ERK 信號通路的激活，然而該模式具體的發生機制尚不清楚［8］；③線粒體DNA 釋放式NETosis：此類NETosis 同樣依賴于ROS 的產生，主要由于中性粒細胞受到GM-CSF、C5a 或LPS 刺激，持續約15 min［15］。

2 NETs與IBD的關系

2.1 NETs 放大IBD 的炎癥反應 IBD 主要表現為腸道黏膜慢性、反復發作性、非特異性炎癥反應，研究發現：中性粒細胞的浸潤與內鏡下嚴重程度和全身炎癥指數相關，而血清中C-反應蛋白的水平和糞便中的乳鐵蛋白和鈣衛蛋白可作為腸道炎癥的敏感標志物，值得注意的是，乳鐵蛋白和鈣衛蛋白都是NETs的關鍵組成部分［21-23］。與之相似的是，2012年的一篇研究報道了在UC 患者的結腸組織中檢測到穿透素3（PTX3）、MPO以及NE，三者均為NETs的組成部分［24］。雖然這些分子可以獨立于NETs 分泌，但目前研究表明其在IBD炎癥的發生發展過程中發揮重要作用。BENNIKE 等［11］采用蛋白質組學分析發現，在UC 患者組織標本中，有11種與中性粒細胞及NETs 有關的蛋白質水平升高，并且通過共聚焦顯微鏡觀察在UC 患者的結腸組織標本中進行了驗證。DINALLO 等［25］研究發現，與對照組相比，UC 患者結腸組織中PAD4 和citH3 的表達均增加。體外實驗也表明，NETs 增加了UC 患者固有層單核細胞（LPMCs）炎癥細胞因子（如IL-1β和TNF-α）的產生。可能的機制是NETs 能夠增強UC 患者LPMCs 的ERK1/2的磷酸化，而選擇性的ERK1/2抑制劑——PD98059 顯著降低了NETs 誘導的促炎癥細胞因子的產生。同時在體內實驗中，用3.0%的葡聚糖硫酸鈉溶液（dextran sulphate sodium，DSS）能夠誘導BALB/c 小鼠產生NETs，主要表現為DSS 干預組小鼠結腸組織中PAD4 及citH3 的表達量明顯高于對照組，同時，采用選擇性PAD4 的抑制劑——鏈黑菌素能夠有效地緩解DSS 誘導的炎癥反應。此外，NETs 可引起巨噬細胞釋放促炎癥細胞因子，HU等［26］的研究結果揭示了NETs 作為損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的復合物（包含DNA、組蛋白和絲氨酸蛋白酶等），在LPS 存在的情況下通過Caspase-1 和Caspase-8 的作用誘導巨噬細胞樣J774 細胞產生IL-1β，NET 相關的DNA 和絲氨酸蛋白酶參與了細胞產生IL-1β。而IL-1β 是一種典型的促炎癥細胞因子，可刺激局部和全身炎癥反應。最近的一項研究顯示，NETs能顯著增強單核細胞衍生的巨噬細胞對低劑量LPS的反應，并增加TNF-α、IL-6 和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的釋放，而DNase 可顯著降低該細胞的激活，同時，TNF-α、IL-6和MCP-1分泌量均減少［27］。因此，NETs可能通過附著于細胞外游離DNA（cell-free DNA，cf-DNA）骨架上的蛋白水解酶、顆粒蛋白及增強巨噬細胞產生促炎因子等作用放大了IBD的炎癥反應。

2.2 NETs 加劇IBD 的組織損傷 腸道上皮細胞（intestinal epithelial cell，IEC）損傷導致腸上皮屏障功能受損是UC 的病理生理學表現之一，同時，血管內皮細胞（endothelium cell，EC）受損也會導致局部潰瘍黏膜延遲愈合，加重腸道損傷。GOTTLIEB等［28］研究結果表明，無論是兒童UC 還是CD 患者，NETs的表達明顯高于健康對照組。MARIN-ESTEBAN等［29］的研究結果顯示，PLB-985 細胞系分化的中性粒細胞，在Escherichia coli誘導下產生的NETs 能夠破壞人腸上皮樣細胞Caco-2/TC7 細胞的F-肌動蛋白細胞骨架，可能的原因是鑲嵌于游離DNA 骨架上的組蛋白、蛋白酶及ROS 介導的損傷作用。同時，部分研究指出作為NETs 的重要組成部分，包括蛋白酶3（proteinase 3，PR3）、MPO、NE、組蛋白和組織蛋白酶G等在內的中性粒細胞蛋白的抗中性粒細胞胞質自身抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA），可作為IBD 診斷和預后的生物標志物［30］。這些分子在NETs 形成期間釋放，該過程可能也是ANCA產生的重要原因。此外，體內實驗發現：ANCA可誘導中性粒細胞形成NETs 并激活補體導致內皮損傷，暴露于NETs 的樹突狀細胞可誘導ANCA 產生，而在IBD 患者血清中也能檢測到針對MPO 的ANCA。有趣的是，與CD 相比，針對PR3 的ANCA在潰瘍性結腸炎患者的組織標本中更容易檢測出來，從而可以區分兩種疾病［31］。可能的原因是這兩種疾病釋放出的NETs 在組成成分上存在一定差異。同樣，作為NETs的重要組成部分，NE的水平在IBD 患者糞便中升高，其破壞了上皮屏障功能，而抗彈性蛋白酶治療能夠改善小鼠實驗性結腸炎。另一方面，近期有文獻報道，NETs 分別通過組胺及PR3 介導了小血管炎和敗血癥中血管內皮功能損傷，而此作用在中性粒細胞和血管內皮細胞的體外共培養系統中得到驗證［32］。另外，有研究指出，除了NETs 引起血管內皮細胞的損傷，促進腸道炎癥和潰瘍以外，受損的血管內皮還能轉化為促凝表型，可能與活化的血小板共同作用，導致腸道外血栓的形成。而DNase 處理后，DSS 小鼠結腸炎腸道黏膜上皮細胞及血管內皮細胞死亡明顯低于對照組［27］。因此，NETs可能通過破壞腸道黏膜上皮屏障功能及損傷血管內皮細胞促進IBD的發生發展。

2.3 NETs 促進IBD 的高凝狀態 動靜脈血栓栓塞是IBD 患者死亡的重要原因。近年來，NETs 與動靜脈血栓的研究越來越多，研究表明：NETs 通過自身網狀結構形成一個支架，用于黏附血小板、紅細胞（RBC）和血小板黏附分子，例如纖維蛋白原、血管性血友病因子（VWF）和纖連蛋白。同時，NETs 的許多組成部分均可主動觸發血小板活化和血液凝固，如組蛋白H3和H4對內皮細胞和上皮細胞具有高度的細胞毒性，同時它們也可以觸發血小板聚集。而NE 和組織蛋白酶G 主要通過組織因子途徑抑制劑（TFPI）的蛋白水解作用增強組織因子和XII 驅動的凝血。此外，NETs也可直接結合XII因子，并與血小板共同激活XII因子［33］。HE等［13］研究表明，NETs促進了IBD 患者的促凝活性，同時會加重血栓栓塞事件的發生。其中，TNF-α 在IBD 患者外周血中增加，從而引起NETs 釋放，而以上過程主要與血小板-中性粒細胞相互聚集及宿主細胞與微生物相互作用相關。NETs 誘導產生的ANCAs 可引起磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，并為凝血因子FXa和凝血酶原酶復合物提供結合位點，進一步促進凝血酶和纖維蛋白生成。而凝血酶和FXa除了是凝血過程的被動介體外，還通過PAR 信號參與IBD 患者和小鼠模型中炎癥的惡化和延長［34］。因此作者指出，NETs、磷脂酰絲氨酸及其誘導的凝血酶和FXa在IBD中提供了橋接免疫、炎癥和血栓形成的聯系。此外，NETs 參與血栓形成，通常是由配體結合中性粒細胞Toll樣受體2（TLR2）和TLR4或IgG復合物的受體［35］。此外，體外研究發現，TLR2和TLR4拮抗劑能夠降低PS+血小板的百分比及PS+的血小板微粒含量，同時，TLR4拮抗劑也能降低PS 在人臍靜脈內皮細 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUCECs）的表達［27］。因此，NETs 可能通過影響機體凝血功能在IBD的發生發展過程中起重要作用。

3 NETs與IBD治療的關系

各種靶向NETs 的治療藥物已在臨床中得到運用，如：囊性纖維化、痛風和SLE，預計在IBD 中也可能發揮作用［8，36］。目前，IBD 的常規治療（包括氨基水楊酸制劑、激素等）雖有一定療效，但仍存在部分患者對標準劑量激素反應差，或存在長期激素依賴抵抗情況；而針對部分激素治療效果較差的中重度IBD 患者而言，以抗TNF-α 為代表的生物制劑極大改善了IBD 患者預后生存［37］。有研究指出，TNF-α能誘導UC 患者中性粒細胞產生NETs，而英夫利西單抗（IFX）通過阻斷TNF-α 可顯著降低UC 患者結腸組織中PAD4 和NETs 表達，為臨床上抗TNF-α 治療難治性IBD 提供了一定依據［25］。此外，動物實驗顯示，DSS誘導的UC小鼠腸道的擬桿菌和梭狀芽孢桿菌明顯增加，給予IBD 小鼠模型抗生素或將小鼠重置于無菌環境中都能顯著緩解病情，從而證明腸道菌群在UC 發病中起到一定的作用［38］。VONG等［39］提到，CD患者的結腸組織中能經常分離到黏附侵襲性大腸埃希菌（adherent-invasiveEscherichia coli，AIEC），在使用抗生素的基礎上，該細菌能增加實驗性小鼠NETs 及ROS 的產生。同樣，Afa/Dr 彌散黏附大腸桿菌（diffusely adheringEscherichia coli，DAEC）菌株C1845 誘導NETs 殺死細菌并損傷人腸上皮樣細胞［29］。同時，有研究指出作為一種益生菌——鼠李糖乳桿菌能夠抑制ROS 及NETs 的產生，該現象在體外實驗小鼠骨髓中性粒細胞及人早幼粒細胞系d.HL-60 中得到驗證［40］。基于以上研究，益生菌可能通過NETs 調節黏膜免疫反應，改善腸道菌群比例失調，修復損傷腸道黏膜，從而廣泛用于IBD的輔助治療。此外，由于NETs產生過程的復雜性及組成成分的多樣性，多種物質可直接或間接地作用于NETs，可能成為治療IBD 的前體物質，如作用于cf-DNA 的DNase 1、PAD4選擇性抑制劑鏈黑菌素、ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸、MPO 的抑制劑PF1355、內源性NETosis 的抑制劑前列腺素E2（PGE2）等［8，25，27，36］。因此，NETs 靶向治療將為IBD提供更多的治療選擇。

4 結語

自發現NETs 的10 余年來，有關NETs 的研究成為多種疾病的研究熱點。由于NETs 自身組成成分中含有自身免疫性抗原物質，因此NETs 也與自身免疫性/炎癥性疾病的發生發展密切相關。而炎癥性腸病屬于腸道自身炎癥性疾病，研究結果發現NETs 可能通過放大炎癥反應，加劇組織損傷、促進高凝狀態等過程在IBD 中發揮重要作用，NETs 相關分子很可能成為IBD 治療干預的靶標。然而，NETs在IBD 中具體的作用機制及NETs 與UC 和CD 之間的關系是否存在一定的差異尚不明確，因此，今后需要開展更多高質量的體外及體內研究，以期為IBD 的治療方案和特異性靶點藥物的開發提供新的思路。