T細胞耗竭機制的研究進展①

劉 寧 徐 屹 段丁瑜

(口腔疾病研究國家重點實驗室,國家口腔疾病臨床研究中心,四川大學，成都 610041)

機體受抗原入侵感染后，抗原特異性初始T細胞活化,分化成效應T細胞和記憶T細胞。細胞分化過程伴隨細胞的快速增殖、轉錄、表觀遺傳及代謝活性重編程,并獲得效應T細胞的基本功能,包括細胞增殖及遷移能力的增強。效應T細胞在活化擴增、清除抗原、控制炎癥反應及感染后大部分死亡,小部分轉為記憶性T細胞長期存在。初始T細胞活化和分化是緊密協調的過程,取決于與抗原呈遞細胞相互作用的特征、抗原刺激的持續時間、T細胞受體(T cell receptor,TCR)信號傳導的強度和微環境[1]。在急性感染清除后,記憶T細胞具有很多不同于初始T細胞和效應T細胞或其他T細胞亞群的性質,包括再次遇到抗原后重新激活效應功能、高增殖潛能和在沒有抗原刺激的情況下通過白細胞介素7(interleukin 7，IL-7)和IL-15驅動的穩態增殖能力。這些特性隨著感染時間的推移逐漸獲得,并使T細胞能夠行使保護性免疫功能[2]。然而,在一些慢性感染過程中,抗原特異性T細胞雖然最初獲得了相應的效應功能,但隨著抗原刺激的長時間持續,這些效應功能逐漸減弱至喪失,無法轉換成非抗原依賴性記憶T細胞,這種功能障礙狀態代表了一種T細胞獨特的分化狀態,稱為T細胞耗竭[3]。T細胞耗竭的狀態通常表現為以下幾個特征：①效應功能的逐步缺失;②多種抑制性受體持續上調和共表達;③關鍵轉錄因子的表達和功能發生改變;④免疫代謝紊亂,耗竭的T細胞無法轉化為非抗原依賴性記憶T細胞[4]。1998年,GALLIOMRE等[5]和ZAJAC等[6]在小鼠慢性病毒感染的研究中將T細胞耗竭描述為病毒慢性感染期間抗原特異性T細胞的功能障礙。 從那以后,T細胞耗竭在多種動物模型和人類慢性病毒、細菌、寄生蟲感染以及癌癥中得到證實[7]。近年來T細胞的耗竭機制及耗竭狀態的逆轉已經成為慢性感染、腫瘤及自身免疫性疾病等多個領域的研究熱點。

研究表明,持續性的慢性感染如結核分歧桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染、布魯桿菌感染等可誘導T細胞進入耗竭狀態,以逃避宿主免疫機制。慢性牙周炎是口腔內最常見的持續性的慢性感染,多種牙周致病菌通過不同的方式抑制或逃避宿主防御功能,如產生降解IgA和IgG的酶,抑制白細胞的吞噬功能,侵入牙齦上皮細胞并增殖以躲避宿主防御機制,導致感染慢性化,疾病遷延不愈。既往研究表明，在慢性牙周炎中T細胞耗竭相關標志分子存在變化,因此,本文對T細胞耗竭的機制和研究現狀進行綜述,并總結和展望其與慢性牙周炎發生發展可能的聯系,為相關研究提供新的切入點和新思路。

1 耗竭T細胞的特征

1.1功能障礙和功能喪失 在效應功能方面,耗竭T細胞會出現逐步漸進的功能障礙和功能喪失。通常,產生IL-2、高增殖能力和離體殺傷等功能首先喪失,其他功能如產生腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)的能力往往在功能障礙的中間階段喪失。嚴重耗竭最終會導致T細胞部分或在某些情況下完全缺乏產生大量IFN-γ、β-趨化因子或脫顆粒的能力。耗竭的最后階段是T細胞的消失[2]。

1.2抑制性受體的表達 抑制性受體的持續性表達上調和多種抑制性受體的共表達是耗竭T細胞在慢性感染或腫瘤免疫應答過程中的重要特點。最先發現的抑制性受體是CD28家族的跨膜蛋白受體：程序性死亡受體-1(programmed cell death 1,PD-1),其兩種已知的配體是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)[8]。PD-1/PD-L1免疫檢查點在外周組織中起作用并且充當T細胞的負調節劑以幫助控制局部炎癥反應并維持自身耐受性[9]。 FREEMAN等[10]研究發現PD-L1信號傳導可以抑制TCR介導的T細胞增殖。PD-1-PD-L1相互作用會下調CD3/CD28 T細胞對抗原刺激的反應能力。而后,BARBER等[11]對淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)慢性感染期間病毒特異性CD8+T細胞的基因表達譜進行分析后發現,功能耗竭的CD8+T細胞的PD-1 表達上調,并且體內施用抗體阻斷該抑制性受體與其配體PD-L1的相互作用可以改善耗竭T細胞的效應功能。隨后發現在其他持續性病毒、非病毒感染以及癌癥中，PD-1途徑在抑制抗原特異性T細胞的有效性方面也具有重要作用[7,12]。 另一CD28家族成員T 細胞殺傷相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)也被發現與T細胞耗竭相關。研究顯示,機體感染人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)或丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)后,CTLA-4的高表達可以影響T細胞應答功能的質量[13-15]。此外,在HIV、HCV和LCMV感染期間,T細胞表達T細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3,Tim-3)的頻率和水平與細胞耗竭狀態和感染嚴重程度呈正相關[16-18]。除了上述幾種抑制性受體之外,越來越多的研究將B和T淋巴細胞衰減因子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、CD160和CD244等抑制性受體的表達與慢性感染、自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡)及某些癌癥(如胸腺瘤、肺癌)中的T細胞耗竭現象聯系起來[19]。

在LCMV慢性感染過程中,研究者發現在相同的病毒特異性CD8+T細胞上存在多種抑制性受體的大量共表達,且抑制性受體共表達的程度與感染的嚴重程度相關[3]。共表達Tim-3和PD-1(Tim3+PD1+)的CD8+T細胞比僅表達PD-1(Tim3-PD1+)的CD8+T細胞表現出更嚴重的耗竭現象。與僅阻斷其中任一途徑相比,同時對Tim-3和PD-1途徑進行體內阻斷在恢復T細胞的抗病毒免疫和病毒控制方面具有協同效應[20]。此外,在感染邊緣蟲的牛體內也發現了PD-1和淋巴細胞活化基因3( lymphocyte activation gene 3,LAG-3)的共表達，且兩種受體的共表達可促進T細胞耗竭[21]。這些研究提示多種抑制性受體可共同表達,并且在T細胞耗竭過程中可能起協同作用。

1.3表觀遺傳學特點的改變 T細胞發生耗竭后也會表現出轉錄譜及染色質的廣泛改變。一些轉錄因子如NR4A、T-bet、 Eomes、Blimp-1、NFAT、 BATF 和 VHL雖然也在正常效應T細胞內發揮作用,但在耗竭T細胞內的功能卻不同于其他T細胞亞群[22]。比如近期研究發現NR4A是誘導T細胞耗竭的關鍵調節因子[23-24]。耗竭CD8+T細胞缺少幾個存在于正常效應T細胞和記憶T細胞fng基因座上的開放染色質區域(chromatin accessible region,ChAR),然而卻檢測到耗竭CD8+T細胞的特異性ChAR,該區域位于編碼PD-1的Pdcd1基因的上游23.8 kb堿基處,在該區域發現了調節基因表達的轉錄因子(RAR,T-bet和Sox3)的潛在結合位點。當這些轉錄因子結合位點發生突變后,淋巴細胞的PD-1表達受到抑制。這表明 -23.8 kb ChAR 存在于耗竭T細胞但不存在于正常T細胞中,并作為增強子維持耗竭CD8+T細胞PD-1的高表達[25-26]。相關領域有待進一步研究，以為慢性感染性疾病的防治提供新思路。

2 T細胞耗竭發生發展的相關因素

2.1抗原刺激水平和持續時間 抗原水平和抗原持續刺激時間是誘導T細胞耗竭的重要因素。在小鼠中發現,持續抗原呈遞直接驅動慢性病毒感染期間的T細胞耗竭[27]。小鼠感染LCMV慢性株后,如果早期(感染后大約1周)將CD8+T細胞從持續抗原刺激中分離出來,則這些細胞可分化成功能完全的CD8+記憶T細胞。然而，如果這些T細胞暴露于持續存在的抗原2～4周,T細胞耗竭變得確立,這些細胞則不能簡單地通過從抗原暴露中移除而恢復正常記憶分化[28-29]。持久痰抗酸陽性空洞型肺結核患者體內大量結核分枝桿菌持續感染也可能引起T細胞功能耗竭的發生[30]。此外,慢性抗原刺激還通過轉錄因子NFAT導致PD-1的持續表達[31]。 上述研究表明慢性抗原刺激、感染的水平以及持續時間可能是導致T細胞耗竭的關鍵因素,并且與慢性感染期間功能障礙的嚴重程度相關。

2.2CD4+T細胞及NK細胞 在慢性感染中,CD4+T細胞對調節CD8+T細胞的應答起重要作用。CD4+T細胞通過CD40和CD40配體相互作用激活專職抗原呈遞細胞如樹突狀細胞,分泌趨化因子和細胞因子,其將初始T細胞引導至次級淋巴器官中并激活,誘導T細胞至感染部位,同時CD4+T細胞產生的細胞因子,包括IL-2和IL-21,可直接作用于CD8+T細胞[32]。病毒慢性感染的小鼠體內CD8+T細胞初次免疫應答時，CD4+T細胞的短時缺失可以導致CD8+T細胞出現嚴重耗竭和高病毒載量[33]。在LCMV小鼠的研究中發現,初始和抗原特異性效應CD4+T細胞的有效輔助作用可逆轉體內已經出現耗竭現象的CD8+T細胞[34]。近期研究發現，感染引起免疫反應的初期CD4+T細胞通過誘導對記憶性T細胞回憶反應來限制T細胞的耗竭[35]。此外,CD8+T細胞耗竭狀態也受到NK細胞的影響,NK細胞可通過直接殺傷限制APC的活化能力,產生免疫調節性細胞因子如IL-10,以及剔除有助于應答的CD4+T細胞等方式來抑制抗病毒CD8+T細胞的免疫功能[36-37]。

2.3可溶性細胞因子和抑制性受體 可溶性細胞因子如IL-10和TGF-β也影響T細胞的免疫功能狀態。IL-10是一種可減弱炎癥反應的免疫調節細胞因子[38]。研究發現,IL-10在幾種病毒持續感染期間(包括EBV、HBV、HCV、HIV和LCMV)表達水平上調。而IL-10的阻斷可增強病毒控制并改善耗竭T細胞的應答。提示IL-10在限制免疫介導的病毒控制和T細胞耗竭發展中發揮作用[2,22]。TGF-β通過影響多種免疫細胞譜系的增殖、分化和存活來控制免疫應答并維持免疫穩態[38]。病毒特異性CD8+T細胞中指示TGF-β信號傳導的信號轉導物Smad2在慢性LCMV感染中的磷酸化比在控制良好的感染期中更強[39]。而阻斷T細胞接受TGF-β信號的通路可改善慢性LCMV感染期間CD8+T細胞的功能,并防止CD8+T嚴重耗竭和某些CD8+T細胞特異性的缺失[39]。在腫瘤微環境中也發現IL-10和TGF-β的存在可以抑制T細胞的功能[38]。

與細胞因子相似,抑制性受體也影響慢性感染及腫瘤中T細胞的功能及狀態。耗竭CD8+T細胞表達多種抑制性受體,抑制性受體共表達的模式影響慢性感染期間這些T細胞的功能質量，且慢性感染的嚴重程度與表達的抑制性受體的數量和強度相關[3]。抑制性受體可以在幾個水平上抑制T細胞功能：與共刺激受體競爭結合共享配體或干擾形成微團聚體和脂筏;干擾共激活TCR;上調參與T細胞功能障礙的基因[19]。

耗竭T細胞的發生和發展是一個多種因素相互影響的復雜過程。CD4+T細胞、NK細胞、B細胞或細胞因子應答等任何方面的改變都可能導致機體對感染或腫瘤的有效控制變差,由此導致更高的抗原載量,從而進一步推動耗竭狀態的發展。而每種影響因素對耗竭T細胞發生與發展產生影響的具體作用機制有待于進一步研究。

3 耗竭T細胞功能狀態的逆轉。

3.1逆轉耗竭T細胞功能狀態的方法 耗竭T細胞雖然表現出免疫功能障礙,對慢性感染和腫瘤細胞會失去有效控制,但T細胞耗竭并不是不可逆的終末狀態。目前大量實驗及臨床研究顯示通過阻斷抑制性受體、阻斷抑制性細胞因子或基因靶向療法等方法均可以在一定程度上改善T細胞的功能狀態,提高對病毒、腫瘤細胞及細菌的清除率。

PD-1的治療性阻斷通過重新編碼代謝過程、促進增殖和上調效應分子的表達來重新激活耗竭T細胞的免疫反應[4]。在腫瘤微環境的研究中發現,抗PD-L1的治療性阻斷可重新激活及改善部分耗竭CD8+T細胞的代謝功能[40]。慢性病毒感染相關研究中發現,在T細胞耗竭發生后施用抗PD-L1或抗PD-1阻斷抗體可提高CD8+T細胞增殖能力,增加細胞因子產生和增強細胞溶解活性并減少病毒載量[11]。此外,在實驗性腫瘤模型中,抗CTLA-4或抗PD-1抗體可以增強耗竭CD8+T細胞的糖酵解能力和效應功能[40]。除了阻斷單一的抑制性受體,近年來研究也發現Tim-3、LAG-3或TIGIT與PD-1途徑同時阻斷對逆轉T細胞耗竭具有協同作用,可以更有效地改善T細胞功能并有助于病毒和腫瘤細胞的清除[21,41-42]。從免疫療法的角度來看,調節細胞因子對耗竭CD8+T細胞的作用也是改善慢性感染和癌癥期間生物學結果的有前景的治療方法。 例如，IL-2給藥在1992年被批準用于治療轉移性腎癌,并且在證明IL-2治療在這些疾病中有一定功效后于1998年用于轉移性黑素瘤,而阻斷IL-10受體也可以改善病毒控制并減少T細胞耗竭程度[21,43-44]。

3.2影響耗竭T細胞功能狀態逆轉的因素 雖然通過阻斷抑制性受體及配體或某些細胞因子來逆轉T細胞耗竭狀態的方法在臨床上已經成為慢性感染和腫瘤的治療性干預措施,但其效果受到很多因素的影響。首先,治療開始前T細胞耗竭的程度不同會導致治療效果的不同[22]。而且PD-1阻斷的有效性取決于T細胞群的性質,如PD-1阻斷可以逆轉PD-1intT細胞(PD-1中量表達T細胞)的耗竭,但不能逆轉終末分化的PD-1hiT細胞(PD-1高表達T細胞)[45]。且阻斷PD-1后耗竭CD8+T細胞的再活化必須依賴于CD28信號的傳導[46]。此外,耗竭T細胞的再激活可能依賴于T細胞與B7+造血細胞的相互作用,如樹突狀細胞[47-48]。盡管阻斷抑制性受體對細胞免疫應答具有改善作用,但也可能發生不利影響。這些不利影響可以由增強的T細胞應答引起的免疫病理改變引起,如果在慢性LCMV感染過程中過早阻斷PD-1受體通路,則會發生這種免疫病理改變。在感染猴免疫缺陷病毒的獼猴體內阻斷CTLA-4會出現其他抑制性分子使淋巴細胞反應降低,導致CD4+T細胞的損失和病毒載量的增加,反而降低了抗病毒治療的效果[49]。

4 耗竭T細胞與細菌感染性疾病的關系

對耗竭T細胞的研究主要集中在慢性病毒感染和腫瘤方面,但已有研究表明在多種細菌感染中也存在T細胞耗竭現象。

在幽門螺桿菌感染的體外實驗中發現,當胃上皮細胞受到幽門螺桿菌持續性刺激時會出現PD-L1高表達,PD-L1可以抑制T細胞增殖,用特異性抗體阻斷PD-L1后可以逆轉該抑制作用[50]。體內研究中同樣發現了T細胞耗竭現象。在小鼠布魯氏桿菌感染實驗中,與急性感染或非感染小鼠相比,來自慢性感染小鼠的脾臟中耗竭表型的CD8+PD-1+LAG-3+細胞明顯增加,而這些耗竭表型的CD8+T細胞缺乏IFN-γ的表達。 這些結果表明,布魯氏桿菌慢性感染導致CD8+T細胞出現耗竭狀態從而限制其免疫功能[51]。在感染MTB的小鼠模型中發現,MTB慢性感染期間T細胞高表達Tim-3,且這些T細胞同時表達包括PD-1在內的其他抑制性受體,同時IFN-γ表達降低,IL-10表達增高,并表現出功能障礙,無法有效清除細菌。而阻斷Tim-3可逆轉T細胞的功能并且改善對MTB的控制[52]。

在相關臨床研究中同樣發現了T細胞的耗竭現象。活動性肺結核患者與健康人相比，PD-1在CD4+T細胞中表達增加而在CD8+T細胞中沒有增加。此外,與健康對照相比,PD-L1和PD-L2在MTB感染患者的單核細胞中表達上調。阻斷CD4+T細胞和巨噬細胞上的PD-1/PD-L1途徑增強了巨噬細胞體外吞噬作用和細胞內殺滅MTB的作用,表明PD-1在MTB感染中具有免疫負調節作用[53]。在敗血癥患者體內也有類似的發現。在多重藥物耐藥性( multidrug-resistant,MDR)細菌性膿毒血癥患者中發現,與非膿毒血癥患者相比,感染MDR細菌的膿毒血癥患者的抑制性受體PD-1及其配體PD-L1的表達上調。3種免疫佐劑包括IL-7、抗PD-L1和OX-40L,在MDR細菌性膿毒血癥患者中有效增加了T細胞的IFN-γ產生率[54]。

在口腔研究領域，耗竭T細胞重要的分子標記物之一PD-1/PD-L1與慢性口腔疾病之間的關系也引起了關注。相關臨床研究發現，PD-1、PD-L1、CTLA-4在慢性根尖周炎病損部位的表達量明顯高于對照組。牙周炎患者外周血單核細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞的PD-1表達量明顯高于牙齦炎患者和健康人,而經過牙周基礎治療后PD-1及PD-L1的表達量較治療前有不同程度的降低[55-56]。也有研究表明 T 淋巴細胞表面 PD-1的表達量與血清及齦溝液中 IL-1β、IL-8、TNF-α、sICAM-1、sVCAM-1、MMP-1、MMP-7、MMP-13等致炎因子的含量呈正相關[57]。

5 展望

目前關于耗竭T細胞發生與發展機制已有大量研究,相關的動物實驗及臨床研究也為免疫靶向治療揭示了新的可能性。然而,對耗竭T細胞的研究及應用主要集中在病毒及腫瘤領域,在許多慢性感染性疾病中的研究尚不充分。細菌感染后若不能被宿主盡快清除,可能通過各種不同途徑限制宿主的免疫功能,細菌感染性疾病由此在宿主體內變得遷延不愈,使感染和炎癥慢性化，T細胞的耗竭可能是其中重要原因之一。為慢性感染性疾病的防治提供新思路。