腹瀉型腸易激綜合征中醫病證結合動物模型研究?

楊清瑞， 胡澤玉， 杜曉泉， 周 鋮， 劉海濤

(1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院，陜西 咸陽 712000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種以腸功能紊亂為主的臨床綜合征，主要特征為腹部疼痛不適反復發作，常伴隨糞便性狀和排便習慣的改變[1]。建立有效且擬合臨床度高的腸易激綜合征中醫證候動物模型，可以為本病的中醫藥治療及相關科研提供重要幫助。目前IBS動物模型的相關研究尚處于探索階段,造模方法尚不成熟,缺乏統一公認的復制方法。動物模型能否充分反映IBS的疾病特性，決定了研究結果的準確性及合理性。因此，為探究腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)中醫病證結合動物模型復制方法，遂整理分析現有中醫證候模型復制方法的文獻，將切實可行的復制方法詳述，以期在IBS-D中醫證候動物模型的選擇方面為本領域研究者提供有效參考。

1 動物模型造模思路概述

目前，腸易激綜合征的病因及發病機制尚不清楚。最新的共識指南認為，主要與內臟高敏感、腸-腦互動異常、腸道動力異常、胃腸道激素、腸道感染、腸道微生物、精神心理障礙以及遺傳和飲食等多種因素相關[2]。在臨床根據排便特點和糞便形狀，可將IBS分為腹瀉型、便秘型、混合型、未定型[3]。根據IBS的主要癥狀，其屬于中醫學“腹痛”“泄瀉”“便秘”等范疇。同時，根據《腸易激綜合征中醫診療專家共識意見(2017)》[4]，將IBS-D分為肝郁脾虛證、脾腎陽虛證、寒熱錯雜證、脾虛濕盛證、脾胃濕熱證5種證型。近年來，諸多學者為IBS病證結合動物模型的構建和評價奠定了大量理論與實踐基礎,促進了IBS病證結合動物模型的發展。目前，已有的腸易激綜合征腹瀉型中醫病證結合動物模型的復制方法有肝郁脾虛型、脾胃濕熱型、脾胃虛寒型、脾腎陽虛型，其構建方法主要是在現代醫學疾病動物模型的基礎上，結合情志與證候多因素制備而成，即分別復制出IBS動物模型和中醫證候動物模型，疊加之后形成“病證結合”的腸易激綜合征中醫證候動物模型。

2 IBS-D模型常用復制方法及評價指標

2.1 IBS-D模型常用復制方法

常用的IBS腹瀉型動物模型構建方法有早期生活應激、直結腸球囊擴張、化學藥物刺激、病原體感染、復合方法及其他方法等，現將幾種常用的IBS模型復制方法介紹如下。

2.1.1 束縛應激(wrap restraint stress,WRS) 使用包裹局部約束壓力(WRS)程序誘發壓力。先用異氟烷麻醉大鼠，然后用膠帶束縛大鼠的前上肢和胸部2 h，每天1次[5]。

2.1.2 直結腸球囊擴張(colorectal distension,CRD) 對出生第8天的乳鼠進行直結腸球囊擴張刺激,向血管成形術的球囊(2 cm×0.3 cm)中注入0.3 mL的水，施加等同于60 mmHg的壓力刺激1 min,每天2次(相隔30 min),共刺激2周[6]。

2.1.3 旋毛蟲感染(Trichinization) 將含有旋毛蟲感染的大鼠肌肉切碎后置于37 ℃的消化液(含有1%胃蛋白酶A和1%HCl)中16 h。經篩過濾、分離的感染幼蟲用0.85%NaCl洗滌幾次后，給予造模組大鼠0.2 mL懸液(含有8000個幼蟲)灌胃[7]。

2.1.4 乙酸灌腸 給予大鼠乙醚輕微麻醉(吸入30 s)后，在肛內8 cm處滴注1 mL4%乙酸30 s，然后再滴入1 mL磷酸鹽緩沖鹽水稀釋乙酸并沖洗結腸[8]。

2.1.5 母嬰分離(maternal separation,MS) 將出生第2～14天的幼鼠與母鼠分離，放入盒中(規格5 cm×15 cm，溫度32.0 ℃±0.5 ℃)獨處3 h,結束后放回母鼠籠中,每日1次，連續造模14 d[9]。

2.1.6 急慢性應激法 給予大鼠以下刺激：水平振動(120次/min)40 min；禁食24 h；禁水24 h；4 ℃環境3 min；45 ℃環境5 min；夜間連續照明12 h；夾尾1 min。隨機給予模型組上述刺激,且連續2 d給予刺激順序不能相同,連續3周。同時給予紙帶束縛前肩、前上肢和胸部,限制前上肢搔抓頭面部,但不限制其活動,束縛1h[10]。

2.2 IBS模型評價指標

IBS模型的觀測評價指標主要包括腹部撤回反射和胃腸動力的測定，具體評分標準如下。

2.2.1 腹部撤回反射(abdominal withdrawal reflex,AWR) 在直結腸球囊擴張(CRD)下進行評估。評分標準參考文獻[11]：對CRD無反應計0分；身體保持靜止或頭部輕微移動計1分；腹肌收縮計2分；壁從底部抬起并明顯收縮計3分；身體拱起以及骨盆和陰囊的抬高計4分，進行相同的壓力刺激3次，將平均分數作為最終分數。

2.2.2 胃腸動力的測定 在禁食不禁水24 h后,按照10 mL/kg的劑量給予大鼠活性碳墨水灌胃。30 min后用頸脫位法處死大鼠，立即取出整個小腸,剪切過程中不能拉伸。浸入5%福爾馬林液以終止蠕動,然后測量活性碳墨水行進的距離以及小腸的總長度。用活性碳墨水染黑腸管長度/總腸管長度的比例(%)以評估胃腸動力[12]。

3 IBS-D中醫證候動物模型復制方法及模型評價

3.1 肝郁脾虛型IBS-D動物模型復制方法

3.1.1 母子分離+慢性束縛+番瀉葉灌胃法 張北華[13]和趙迎盼等[14]通過動物實驗對3種造模方法進行了比較，最終研究表明，母子分離8周+慢性束縛應激3周+番瀉葉灌胃1周為最佳的肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型，并分為以下3步：(1)幼鼠出生后第2～14天，每天母子分離3 h后放回母鼠籠中。到第22天斷奶，第30天隨機分籠飼養，至8周后體質量超過250 g者進入下一步造模；(2)從第9周開始，每天在自制束縛架上黏貼軟帶束縛大鼠胸部和腹部3 h，連續3周；(3)束縛應激的同時，每天給予番瀉葉水煎劑(濃度0.45 g生藥/mL，劑量4.5 g/kg)灌胃，每日1次，持續1周。

3.1.2 番瀉葉灌胃+慢性不可預知輕度應激法 羅丹妮等[15]采用番瀉葉浸劑灌胃結合慢性不可預知輕度應激(hronic unpredictable mild stress,CUMS)造模方式：(1)給予番瀉葉浸劑(濃度0.3 g/mL，劑量10 mL/kg)灌胃；(2)灌胃1 h后隨機(抓鬮分配法)進行多種慢性不可預見性刺激，包括束縛(固定于木制大鼠束縛固定器上2 h)、夾尾20 min、搖擺-擁擠(1 min內220次,時長1 h，每籠6只)、45 ℃溫水游泳(5～10 min,當大鼠無力游動時立即撈出)、足底電擊(電流1.5 mA,15 min內3次,每次30 s)、擁擠飼養24 h(6只大鼠)、孤養24 h，連續造模14 d。

3.1.3 饑飽失常+番瀉葉灌胃+游泳實驗法 郭紅[16]采用這種方法在禁食12 h(不禁水)后給予大鼠灌胃番瀉葉顆粒劑(濃度0.4 g/kg，劑量1 mL/100 g)；在灌胃1 h后強迫游泳(水溫22 ℃～25 ℃,水深70 cm)，直到大鼠無力游動(頭部沉入水中超過10 s)才撈出，連續造模14 d。

3.1.4 番瀉葉灌胃+束縛應激法 郭軍雄[17]采用以下方法：各組造模大鼠在實驗前10 h禁食不禁水，按照4 g/kg劑量分別給予番瀉葉煎劑灌胃，每天1次，連續灌胃7、14、21 d。采用透明寬膠帶束縛大鼠的前肢、胸部和腹部，限制其搔抓頭面部(但不限制其活動)，束縛1 h,每天1次，分別束縛7、14、21 d。

3.2 脾胃濕熱型IBS-D動物模型復制方法

3.2.1 慢性不可預知輕度應激+高糖高脂飼料喂養法 文獻[18-20]采用以下方法：(1)先將大鼠放入高溫高濕環境造模箱(溫度(32±2) ℃,相對濕度90%～95%)中，給予高糖高脂飼料喂養7 d；第15天時給予白酒(酒精度56%，劑量10 mL/kg)灌胃，每天1次，共7 d。與此同時隨機進行多種慢性不可預見性刺激，包括夜間連續照明12 h，水平振蕩(160次/min)45 min，禁食禁水24 h，(2)45 ℃環境5 min，夾尾1 min，4 ℃冰水游泳3 min。每日隨機給予模型組上述刺激,并每連續2 d給予刺激且順序不能相同,持續造模21 d。

3.3 脾胃虛寒型IBS-D動物模型復制方法

3.3.1 番瀉葉灌胃+束縛應激法 文獻[21，22]采用以下方法：(1)禁食不禁水10 h后給予大鼠番瀉葉水煎劑(濃度0.3 g生藥/mL，劑量20 mL/kg)灌胃，每天1次，連續14 d；(2)灌胃結束后用繩束縛住大鼠的后下肢1 h,每天1次，連續14 d。

3.4 脾腎陽虛型IBS-D動物模型復制方法

3.4.1 番瀉葉灌胃+物理化學刺激法 文獻[23-26]采用以下方法共分為4步:(1)冰醋酸灌腸。用石蠟潤滑后的導管插入大鼠肛門內3～5 cm處，注入0.5%冰醋酸(首劑0.2 mL，每天增加0.1 mL，至0.5 mL時保持不變)，然后倒置大鼠1 min以防漏出，每天1次，連續14 d；(2)直腸擴張。將涂抹石蠟油的兒童型導尿管球囊塞入肛門內2～3 cm處，用5 mL注射器向球囊內充氣(每天2次，每次充氣1.5～2.0 mL，間斷持續3～5 min)，連續14 d；(3)夾尾刺激。間斷持續3～5 min，每天2次，持續2周；(4)疊加脾腎陽虛證模型，給予番瀉葉濃縮劑(濃度0.3～0.5 g/mL，劑量20 mL/kg)灌胃，每天1次，持續4周。

3.4.2 番瀉葉灌胃+避水應激法 侯理偉[27]和朱佳杰[28]采用以下這種方法：給予番瀉葉濃縮劑(濃度1 g/mL，劑量10 mL/kg)灌胃，每天1次，持續28 d。4周后給予避水應激，取一個玻璃水槽(60 cm×30 cm×40 cm),中央有個小平臺(10 cm×10 cm×10 cm)，水槽內注水9 cm,每天將大鼠置于平臺上2 h，連續10 d。

3.4.3 番瀉葉灌胃+直腸擴張法 韓博宇[29]通過對3種造模方法進行動物實驗對比，結果表明高劑量番瀉葉灌胃6周+直腸擴張法為最佳的脾腎陽虛證IBS-D大鼠模型。給予大鼠番瀉葉濃縮劑(濃度1 g/mL，劑量5 g/kg)灌胃，每天1次，連續6周。將涂抹石蠟油的自制球囊插入距肛緣約7 cm處，然后將大鼠置于自制小籠中使其不得轉頭,給予直結腸球囊擴張(壓力80 mmHg，每天2次，每次間斷持續5 min)，連續14 d。

3.4.4 番瀉葉灌胃+束縛應激法 譚瑋璐[30]和武志娟等[31]采用以下方法：(1)禁食24 h(不禁水)后給予大鼠番瀉葉溶液(濃度200%，劑量20 mL/kg)灌胃，每天2次，連續14 d；(2)灌胃1 h后，用透明膠帶束縛大鼠的前肢、肩部和胸部1 h，限制其搔抓頭面部(但不限制其他活動)，每天1次，連續14 d。

3.5 IBS-D中醫證候模型評價

IBS-D中醫證候模型的宏觀評價指標，主要記錄大鼠每天的精神狀態、活動情況、進食、皮毛色澤、口唇黏膜、體質量變化、糞便性狀等一般狀態。

3.5.1 肝郁脾虛證 各模型組大鼠神態倦怠易激惹，防御性強，毛發干枯散亂無光澤，消瘦，食欲減退，活動減少，反應遲緩，扎堆或蟄伏在角落，多數弓背靜臥少動，眼角有分泌物，大便變軟或不成形，肛門部有糞便污物附著等，類似中醫肝郁脾虛表現[13-15,17]。

3.5.2 脾胃虛寒證 造模后大鼠初期表現為極度煩躁,尖叫易怒，后來開始腹瀉、毛發無光澤、消瘦、活動減少、精神萎靡，類似中醫脾胃虛寒表現[22]。

3.5.3 脾胃濕熱證 造模后IBS模型組大鼠易激惹，糖水攝取量明顯減少，大鼠精神倦怠，萎靡不振，反應遲鈍，嗜臥，活動減少，大便稀或溏泄,肛周污穢，皮毛枯槁無光澤,豎毛，飲食量下降，體質量增長緩慢，類似中醫脾胃濕熱表現[19]。

3.5.4 脾腎陽虛證 造模后大鼠的活動開始減少，精神倦怠；隨著時間延長，出現萎靡不振，蜷臥貼籠，拱背，扎堆，大鼠洗臉、舔足、理毛的動作減少，皮毛發黃少光澤，胡須下垂，活動量少，反應遲緩，體質量下降，飲水增多，進食減少，排便次數增多，肛周糞便污物附著[23,27，28]。

4 討論

腹瀉型腸易激綜合征中醫病證結合動物模型是西醫辨病和中醫辨證相結合的復合模型，其本質是模擬臨床中西醫結合模型，是目前較為符合臨床的一種中醫證候動物模型復制方法。當前IBS中醫病證結合動物模型復制方法主要分2種，一是先構建IBS模型,在此基礎上再復制中醫證型模型；二是先復制中醫證型，在此基礎上再構建IBS模型。

雖然這些模型的復制方法同時兼顧IBS的西醫病理表現和中醫證候的病機特征，有利于研究疾病不同證型宏觀與微觀的具體生物學表現，為中醫藥治療疾病提供客觀化證據，但仍有一些地方有待商榷。如在IBS中醫證候模型的復制過程中，不同的中醫證型使用相同或相似的造模方法，容易造成臟腑兼證候的混淆。筆者所納入的文獻研究中，肝郁脾虛型[17]、脾胃虛寒型[21，22]和脾腎陽虛型[30，31]IBS動物模型的復制方法都有使用番瀉葉灌胃聯合束縛應激的復合造模法，雖然造模藥物的用量及用法有所不同，慢性應激刺激的強度也不一樣，但也很難判定復制的IBS動物模型中醫證候的真實屬性。在中醫證候模型的評價指標中，僅以宏觀體征和行為表現中包含的中醫證候臨床表現為判定依據，使得中醫證候模型的評價標準不夠客觀和科學，不但影響了中醫證候建模率和后續實驗的進展，還降低了造模方法可復制性，實驗結果難以得到其他學者的認可和推廣。

鑒于此，有學者[32]提出從生物代謝的視角來認識中醫藥的現代內涵，通過代謝組學的研究方法獲取人體內動態代謝變化的綜合信息，從而提供中醫證候的量化證據并闡明中醫藥的機理。

因此，后續開展的中醫實驗研究可以從多途徑探索機體與內外環境之間的整體性規律，進而建立起病證結合動物模型客觀、準確的評判標準和體系，并探索更加科學合理的中醫證候與動物模型相結合的方法，為中醫藥治療腹瀉型腸易激綜合征的實驗研究提供更有效的工具。