非洲豬瘟病毒結構蛋白CD2v的功能研究進展①

王 曼 沈宇清

（東南大學醫學院，南京210000）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）類屬非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是一種有包膜的、核衣殼呈二十面體對稱形態的病毒。ASFV基因組由線性的雙鏈DNA 組成，大小為170～193 kbp。其中包含150～167個開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼150～200 種蛋白質。ALEJO 等［1］利用蛋白質組學分析鑒定出68種病毒蛋白，僅占基因組編碼能力的39%。這些蛋白在病毒組裝、基因轉錄和RNA 修飾、維護基因組完整性、入侵宿主和免疫逃逸等方面發揮著重要作用。

ASFV 的感染與傳播途徑為野豬-軟蜱-家豬。首先是疣豬、叢林豬等因為某種不明確的途徑被感染，軟蜱叮咬被感染豬而攜帶病毒，繼而叮咬家豬后將病毒傳播給家豬。在傳播過程中，疣豬等天然宿主的臨床癥狀很輕，而家豬感染后會出現急性出血熱，病死率很高。軟蜱作為病毒的生物載體和貯藏庫對病毒的傳播起關鍵作用。

ASFV 的致病機制十分復雜，目前尚未完全解析。ASFV 的主要宿主細胞是單核細胞和巨噬細胞，也能感染樹突狀細胞。它通過宿主巨噬細胞中網格蛋白介導的內吞作用和巨噬細胞胞飲作用進入細胞。病毒進入內體中，在內體內發生脫殼，病毒核酸物質通過微管系統遷移到病毒工廠進行復制［2-3］。感染的巨噬細胞還可能通過分泌IL-1α、TNF-α 等細胞因子來誘導未感染的T、B 淋巴細胞大量凋亡，從而導致免疫系統功能受損［4-5］。

目前，ASFV 中的p72、p30、p54 等蛋白的研究進展已被許多綜述提及，而本文主要關注的是ASFV的CD2v 蛋白［6-7］。CD2v 是由ASFV 的EP402R 基因編碼的病毒外膜糖蛋白，也被稱為pEP402R。它由402個氨基酸（amino acid，aa）構成，預測的蛋白質大小為46.5 kD［8］。因其aa 序列與T 淋巴細胞表面黏附受體CD2 具有很高的相似性，被認為是CD2 的同源物。CD2v在促進病毒復制與傳播、病毒免疫逃逸等方面發揮著重要作用，也是ASFV 疫苗研究的熱點靶標。

1 ASFV包膜蛋白CD2v的結構特征

CD2v 是一種病毒包膜蛋白，其結構被分為4 個結構域：①20 個aa 構成的N 端信號肽結構域［9］；②183 個aa 構成的胞外結構域，此結構域存在高度的糖基化現象［10］；③25 個aa 構成的疏水跨膜區域；④174 個aa 構成的胞內結構域。當ASFV 入侵宿主細胞后，CD2v 會在內質網或高爾基體中被切割，經切割后產生的63 kD 的N 端以糖基化形式存在，而26 kD的C端以非糖基化形式存在［10］。

測序結果顯示，CD2v與CD2的胞外結構域具有很高的相似性，但胞內區域序列的相似性較低。CD2v C 端包含11 個重復的六肽序列PPPKPC，為CD2v 的特有序列。在C 端還存在一段富含脯氨酸的酸性結構域，其功能尚未被解析。

2 CD2v在ASFV致病機制中的作用

2.1 介導紅細胞吸附，促進病毒的體內播散 大多數的ASFV 毒株都能誘導紅細胞吸附，其特征是豬紅細胞黏附在病毒感染細胞的表面，從而使得感染細胞能夠隨著紅細胞傳播。RODRíGUE 等［9］發現CD2v 的破壞會抑制ASFV 感染細胞與豬紅細胞的黏附能力，說明CD2v 在介導感染細胞與紅細胞黏附中起主要作用，借此參與病毒的體內播散。

CD2v能夠增加軟蜱中病毒的復制。ASFV可以在軟蜱體內復制，存活時間長達3～5年，并可通過軟蜱叮咬傳播給家豬等易感動物。ROWLANDS 等［11］發現天然低毒性ASFV 分離株NH/P68 基因組中CD2v 基因被破壞。他們通過在NH/P68 中過表達CD2v 基因，使其恢復了紅細胞吸附表型，并發現重組病毒在軟蜱中能夠建立持續感染，證明了CD2v蛋白具有介導紅細胞吸附并增加ASFV 在宿主中傳播功能。

2.2 協助病毒定位病毒工廠，促進病毒的細胞內復制 CD2v的C端序列能夠幫助ASFV定位在病毒工廠（viral factory，VF）區域附近從而促使病毒的復制。在病毒的復制周期中，病毒在離散的細胞質區域內進行蛋白翻譯和結構組裝，該區域被稱為“病毒工廠”。其定位特點為在工廠的外圍分布著磷酸化的翻譯起始復合物eIF4F。ASFV 晚期mRNA 以及核糖體、線粒體等細胞器也位于這些區域［12］。VF位于靠近細胞核的細胞質中，由中間絲蛋白Vimentin所包繞［13］。GOATLEY 等［10］將V5 標簽插在CD2v 基因的5'端，將HA 標簽插在CD2v 基因的3'端，構建成質粒SV5CD2vHA。同時還構建了1 個刪除了大部分胞內序列的突變質粒SV5CD2v-cytoHA。他們將2 種質粒分別轉入細胞，然后用ASFV BA71V 病毒毒株進行感染，18 h后分別用抗V5抗體、抗HA抗體和抗VP72 抗體（針對ASFV 主要衣殼蛋白的抗體）對表達SV5CD2vHA 蛋白和SV5CD2v-cytoHA 蛋白的細胞進行染色。結果發現，SV5CD2vHA蛋白無論是用抗V5 抗體還是用抗HA 抗體檢測，都與用抗VP72 抗體鑒定的病毒工廠共定位，而SV5CD2v-cytoHA 蛋白并沒有出現與病毒工廠共定位現象。因此推測SV5CD2v-cytoHA 中缺失的胞質片段是CD2V蛋白定位在VF所必需的，即CD2v的C端序列能夠幫助其定位在VF附近，從而促進病毒的復制。

2.3 影響病毒的體內復制，但不影響病毒的毒力8-DR 和EP402R 均為編碼CD2v 的基因名稱。BROCA 等［14］構建了ASFV 分離株Malawi Lil-20/1 的基因缺失突變體Δ8-DR 及其回復突變體8-DR.R。在體外，Δ8-DR、8-DR.R 和親本病毒在豬巨噬細胞培養物中表現出難以區分的生長特征。為了更詳細地比較它們致病力的差異，BROCA 等［15］將3 株病毒分別感染模型動物。在感染后2 d、4 d、6 d 和8 d處死動物并收集組織樣本，測量其中病毒的滴度。他們發現感染了Δ8-DR 病毒的豬淋巴組織和骨髓中病毒滴度較野生豬和8-DR.R 低，這表明CD2v 在一定程度上影響了病毒的體內復制能力。但是他們也發現Δ8-DR、8-DR.R和親本病毒在模型動物的疾病發作、病程和死亡率上都相似，因此CD2v 不影響病毒的毒力。與此一致的是，BROCA 等［15］發現從 ASFV 分離株Georgia2010 的基因組中刪除8DR基因（ASFV-G-Δ8-DR）并不會顯著改變病毒的毒力。他們證實感染ASFV-G-Δ8-DR 與親本病毒的動物臨床癥狀非常相似，只是在病毒滴度上顯示出一些差異。除此之外，RAQUEL等［16］發現低毒性ASFV分離株NH/P68 除了包含8DR 的突變外，它還具有MGF360和505基因的缺失。已有研究表明MGF360和505 基因與ASFV 的毒力密切相關，這可能才是NH/P68 株毒力降低的主要原因［17］。綜上所述，雖然CD2v 影響病毒的體內復制，但并不影響病毒的毒力。

2.4 參與病毒的免疫逃逸 CD2v 的C 端的重復序列PPPKPC與SH3P7蛋白的相互作用可能參與ASFV的免疫逃逸。KAY-JACKSON等［18］利用酵母雙雜交系統，將SH3P7基因分別與CD2vi（編碼221 aa～342 aa，包含C 端的重復序列）、CD2vii（編碼221 aa～306 aa，不包含C端的重復序列）、CD2viii（編碼297 aa～335 aa，僅包含C端的重復序列）基因共轉化酵母，通過檢測β-糖苷酶的表達來定位CD2v 與SH3P7 相互作用的區域。結果發現只有CD2vi 和CD2viii 出現了陽性的相互作用，說明CD2v通過C端的重復序列結構與SH3P7 相互作用。SH3P7 是一種多功能的銜接蛋白，它能夠偶聯細胞膜受體與肌動蛋白細胞骨架參與淋巴細胞的活化，能夠通過GTPase依賴性方式定位在肌動蛋白組裝的位點、細胞生長的區域和細胞運動的前沿，也能調節JNK1 的信號傳導過程從而激活轉錄因子［19-20］。由于SH3P7 與肌動蛋白組裝和高爾基體囊泡運輸有關，因此CD2v 與SH3P7 的相互作用可能參與ASFV 感染的細胞中肌動蛋白絲的重排和高爾基體的功能，影響多種免疫分子包括細胞因子、黏附因子和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）等的運輸，從而影響免疫系統的識別［21］。

CD2v 與AP-1 的相互作用在免疫逃逸中發揮重要作用。AP-1 是一種銜接蛋白，參與了蛋白質從高爾基體到內體的轉運［22］。它能募集網格蛋白形成囊泡并通過識別膜蛋白胞質尾部的分類信號在胞內的“ 貨物”分類轉運中起關鍵作用。 PéREZNú?EZ 等［23］發現CD2v 的羧基末端能夠與AP-1 結合，并且在ASFV 的感染過程中與AP-1 共定位在病毒工廠的周圍。AP-1 已被證明能夠與多種病毒蛋白包括HIV-Nef 和BPV-E6 結合。這種相互作用被認為能夠破壞宿主細胞胞內一些物質運輸，在病毒感染細胞的免疫逃逸方面發揮作用。如在HIV 的感染中，AP-1 與HIV-Nef 蛋白的結合能夠將MHCⅠ隔離在細胞質中，降低胞膜表面MHCⅠ類分子的表達，從而使病毒感染細胞逃脫CTL 細胞的殺傷［24］。因此推測CD2v 和AP-1 的相互作用在ASFV 的免疫逃逸中具有重要作用，但目前尚缺乏相關實驗證據。

3 CD2v在ASFV疫苗研究中的應用

3.1 基于CD2v 的ASFV 疫苗研究 迄今已有CD2v 應用于減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗和病毒載體疫苗的研究報道。MONTEAGUDO 等［25］刪除了強毒株BA71 的部分CD2v 基因（除了C 末端的其他序列），將其作為減毒活疫苗進行動物免疫。發現BA71ΔCD2v 能夠以劑量依賴的方式保護豬免受ASFV 的攻擊。 該疫苗不僅能夠抵抗同源的BA71 病毒攻擊，也能抵抗異源強毒株E75 的攻擊。BA71ΔCD2v 在COS-1 細胞和豬肺泡巨噬細胞中生長良好而不影響其遺傳穩定性、致病性和免疫原性，適合應用于大規模生產，具有良好的疫苗生產和應用前景。

RUIZ-GONZALVO 等［26］構建了一種能夠表達CD2v 蛋白的重組桿狀病毒。利用3 只豬接種重組CD2v 蛋白后再用野生ASFV 病毒毒株E75 攻擊，最終3 只豬都獲得了保護性免疫并且產生了針對CD2v的特異性抗體。這些結果驗證了CD2v蛋白作為ASFV亞單位疫苗的可行性。

在核酸疫苗研究中，ARGILAGUET 等［27］構建了3 種質粒：pCMV-PQ（表達p54 和p30 蛋白）、pCMVsHAPQ（表達p54、p30 和CD2v胞外端蛋白）和pCMV-UbsHAPQ（表達與泛素融合的p54、p30 和CD2v 胞外端蛋白）作為DNA 疫苗。結果發現，僅有用pCMV-UbsHAPQ 免疫的豬能夠獲得部分免疫保護。因此推測，泛素化CD2v 蛋白可靶向蛋白酶體發生降解，參與MHCⅠ類分子的遞呈途徑，激活特異性T 細胞免疫。實驗證實，經pCMV-UbsHAPQ 免疫后的豬在ASFV 攻擊后，體內CD8+T 細胞數量急劇擴增，說明機體產生針對CD2v的特異性T細胞免疫與該疫苗的保護作用相關。以上實驗均提示CD2v可以作為ASFV疫苗設計和研發的靶點分子。

引起細胞介導的免疫應答的另一種方法是使用病毒載體。BacMam 是一種基于桿狀病毒的載體，通過感染哺乳動物細胞表達靶基因。ARGILAGUET 等［28］構建了承載CD2v、p54 和p30 基因的BacMam-sHAPQ 載體，免疫后通過用ASFV 進行致死性攻擊來測試該疫苗的保護潛力。結果發現在ASFV 感染后，免疫的6 只豬中有4 只豬獲得了保護性免疫，這種保護作用與疫苗接種后產生的病毒特異性T 細胞有關。這些結果進一步驗證了CD2v 在未來疫苗開發中的潛力。

3.2 CD2v 分子的抗原表位研究 BURMAKINA等［29-30］在CD2v中鑒定出了4個T細胞表位，2個位于胞外區，2 個位于胞內區富含脯氨酸的結構域內。應用IFN-γ ELISPOT 實驗評估針對不同的CD2v 表位的應答強度：在模型動物被ASFV 攻擊7～10 d 后分離出外周血單個核細胞，接著通過IFN- γ ELISPOT 測定這些細胞與CD2v 的不同抗原肽孵育后T 細胞的應答程度。實驗發現針對這4 個表位均出現了T 細胞應答，而針對胞內區富含脯氨酸的結構域的T 細胞應答更為強烈，說明這2 個表位是免疫優勢表位，也是疫苗設計的良好靶點。

MINMA 等［31］對ASFV 分離株Georgia 2007/1 的CD2v蛋白主要序列進行了計算機分析，使用計算機模擬方法鑒定CD2v 蛋白的B 細胞和T 細胞表位。通過計算機預測，在CD2v蛋白胞外區（17 aa～204 aa）中鑒定出了4 個B 細胞表位和5 個T 細胞表位。對鑒定出的B 細胞和T 細胞表位進行保守性分析后繪制了CD2v 蛋白序列中免疫表位分布的圖譜，為針對CD2v抗原的疫苗設計提供了幫助。

4 CD2在ASFV基因分型中的作用

SANNA 等［32］提出將CD2v 蛋白C 端重復六肽序列的基因作為一種新的遺傳標記，對來自不同地區的ASFV 進行基因分型，借此追蹤病毒毒株的起源與傳播。針對大量的撒丁島ASFV 樣本，對ASFV 中編碼p72蛋白、p54蛋白和中央可變區的基因進行分析，發現不同病毒分離株的這些基因并無區別。但不同病毒毒株CD2v C 端重復六肽序列的重復數目不同，其基因長度可用于不同病毒毒株的鑒別。MOLINI等［33］也證明CD2v C 端重復六肽序列可對納米比亞ASFV 進行分型。因此，CD2v 可以作為不同ASFV病毒毒株的鑒別標志。

5 小結及展望

CD2v 作為一種結構蛋白，在ASFV 復制、體內播散和免疫逃逸中發揮著重要的作用。CD2v 可以通過介導紅細胞吸附增加ASFV 在宿主中的播散；C 端能幫助病毒定位VF 促進病毒的復制；它還可以與SH3P7 蛋白和AP-1 蛋白相互作用參與病毒的免疫逃逸。對CD2v 蛋白結構和功能的解析促進了它的應用研究。研究人員以CD2v 為靶點進行了減毒活疫苗、亞單位疫苗、DNA 疫苗和病毒載體疫苗的研究，以CD2v 的C 端為遺傳標記進行ASFV 基因分型。

但是對于CD2v 蛋白的結構解析和功能還有許多未解之處：比如目前只解析出CD2v 在體內能夠被加工成3 種形式，但是并沒有確定加工位點及加工后產物的功能。CD2v 蛋白介導感染細胞與紅細胞的黏附，但是它位于紅細胞上的受體尚未找到。CD2v 蛋白C 端的重復六肽序列PPPKPC 和富含脯氨酸的酸性結構域是ASFV 的特異性序列，它們的功能也尚未明確。CD2v 蛋白介導病毒的免疫逃逸機制仍未完全證實。對于這些問題的進一步解決可以幫助人們更加深入地了解ASFV，為非洲豬瘟的防治提供幫助。