低氧預適應下DNA甲基化調控BDNF和Trk B受體的研究進展*

張世紀，付 翁，謝雅彬，謝 偉△，劉 遠

（1包頭醫學院內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室與神經科學研究所，內蒙古包頭014040；2包頭醫學院醫學技術與麻醉學院，內蒙古包頭014040；3首都醫科大學宣武醫院低氧適應轉化醫學北京市重點實驗室，北京100053；4包頭醫學院第二附屬醫院，內蒙古包頭014030）

低氧預適應（hypoxic preconditioning，HPC）是指機體在經歷一次或多次短暫、非致死性低氧刺激后，獲得的對更嚴重甚至致死性低氧/缺血刺激的耐受性，被認為是機體抗低氧/缺血的一種內源性保護現象［1］。雖然HPC可以明顯減輕組織、器官尤其是神經系統的低氧/缺血損傷并產生保護作用［2-3］，但其分子機制還不甚清楚。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其受體原肌球蛋白相關激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）廣泛分布于中樞神經系統內，二者結合后，通過激活BDNF/TrkB信號通路來影響神經元分化、發育、突觸可塑性等過程，并在神經系統中發揮作用［4-5］。已有研究指明BDNF和TrkB是HPC對機體產生保護作用的重要因子［6］，但是HPC調控兩者表達的具體機制還有待研究。DNA甲基化是表觀遺傳學的一種修飾，也是基因表達調控強有力的手段，且在一些神經系統疾病中發現DNA甲基化調控BDNF或TrkB表達的現象［7］。此外，有研究顯示HPC可能對DNA甲基化產生影響［8］。因此本綜述在HPC條件下探討DNA甲基化調控BDNF和TrkB的機制，為后續HPC的神經保護機制研究提供參考資料。

1 HPC與BDNF和Trk B的關系

1.1 HPC對神經系統的保護機制HPC神經保護作用的研究于1986年開始，研究表明HPC可在新生兒缺氧缺血、炎癥［9］、腦卒中［1］、腦外傷性損傷［10］、應激等低氧/缺血刺激中產生明顯的神經保護作用［4］。Xu等［11］的研究得出，HPC通過增加白質中神經纖維束單束的面積來減輕新生兒低氧/缺血損傷導致的白質神經纖維束數量減少；還可以通過激活少突膠質祖細胞的成熟并抑制過度的小膠質細胞活化來部分恢復白質的異常發育，從而促進新生兒感覺運動和認知功能礙的長期功能恢復。由創傷性腦損傷引起的腦缺氧缺血會導致神經元凋亡，HPC通過上調低氧誘導因子1α表達誘導葡萄糖轉運體1和葡萄糖轉運體3蛋白水平升高，從而改善神經元的葡萄糖轉運能力，最終抑制神經元的凋亡［12］。多發性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是中青年人群中常見的自身免疫性神經系統疾病，HPC可通過抑制血管細胞黏附分子1和細胞間黏附分子1的表達，增強中樞神經系統血管完整性，并減輕MS導致的感覺異常［13］。還有研究表明，HPC通過上調縫隙連接蛋白43表達，抑制c-Src蛋白活性，維持海馬CA1區中星形膠質細胞谷氨酸轉運蛋白1和谷氨酰胺合成酶的活性，以對抗短暫全腦缺血導致的神經元谷氨酸過度釋放，防止細胞外谷氨酸積累，減輕短暫全腦缺血造成的神經元死亡［14］。總之，HPC可能通過低氧誘導因子1α或其他轉錄調控機制而上調“好基因”表達或下調“壞基因”表達，從而發揮其神經保護作用［15］。

1.2 BDNF和TrkB在神經系統功能中的作用BDNF是德國神經生物學家Barde在1982年首次從豬腦中分離純化出的一種堿性蛋白，是神經營養因子之一［16］。BDNF在下丘腦、杏仁核、海馬、新皮質等腦區高表達，參與各種神經活動［17-18］。BDNF通過2種不同的受體系統發揮作用，即高親和力的TrkB受體和低親和力的p75受體，p75是所有神經營養蛋白的常見非特異性受體［16，19］。TrkB在學習、記憶、獎勵等各種生理過程中起重要作用［20-21］。BDNF與TrkB結合后能激活3個主要的細胞內信號級聯反應，分別是Ras-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt途徑和磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）-Ca2+途徑［21-23］。以上信號途徑可以增加BDNF的表達和分泌，提升海馬錐體神經元的樹突狀棘密度，并誘導海馬長時程增強（long-term potentiation，LTP）產 生［5，24-25］。此 外，BDNF和TrkB的表達變化與多種神經退行性疾病有關，BDNF水平降低和TrkB信號丟失在阿爾茨海默病、亨廷頓氏病和其他神經退行性疾病的發病機制中起著重要作用［16，22］。BDNF和TrkB及其信號通路被認為是正常神經系統生理功能實現的關鍵因子，因此調整其表達或信號通路活性可能是預防和治療一些神經系統疾病的重要靶點。

1.3 HPC與BDNF和TrkB的關系HPC可通過調控BDNF和TrkB的表達發揮其內源性保護作用［26］。HPC小鼠神經元中的BDNF表達上調可激活BDNF/TrkB信號通路，修復神經元損傷并增加神經元突觸可塑性［27］。HPC可使神經干細胞中BDNF表達升高，在中樞神經系統病灶中植入HPC處理過的神經干細胞可以促進神經再生并促進運動和感覺功能的恢復［6］。同樣，經過HPC處理的人臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）也產生了類似的反應，HPC可以上調人UCMSCs中BDNF的水平，將人UCMSCs移植入損傷的脊髓可以促進細胞存活，減少細胞凋亡，抑制損傷脊髓的炎癥浸潤，同時改善脊髓損傷后的功能恢復［28］。另外，HPC可以通過激活BDNF/TrkB信號通路下游的PI3K/AKT途徑，上調內皮生長因子和肝細胞生長因子的表達，促進內皮細胞的增殖、遷移和管狀形成，最終抑制由缺血刺激引起的間充質干細胞凋亡［29］。還有研究指出，在大腦海馬膠質細胞中過表達BDNF，可增強HPC對氧糖剝奪損傷的神經元和星形膠質細胞的保護作用［30］。此外，HPC同樣引起TrkB的表達變化，在HPC處理24 h內，小鼠海馬中全長型TrkB的表達上調，同時BDNF/TrkB信號通路的活性升高；HPC處理3 d后截短型TrkB表達下降，而且BDNF/TrkB信號的活性升高，神經功能改善，梗死體積減小，受損神經元得以修復［22］。Lee等［31］發現，HPC后BDNF和TrkB的水平幾乎可以恢復到致死性缺血損害前的正常水平，BDNF和TrkB的表達與神經元對缺血性損傷的耐受力有關，有助于神經元對致死性缺血損傷的抵抗。雖然HPC可能通過上調BDNF和TrkB的表達同時激活BDNF/TrkB信號通路來發揮內源性神經保護作用，但是HPC調控BDNF和TrkB表達的機制還需深入研究。

2 HPC與DNA甲基化的關系

2.1 DNA甲基化DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化下，將甲基轉移至DNA分子的堿基上，通過CpG島的甲基化控制靶基因特異性表達［7］。DNA甲基化是不改變DNA一級結構而調控組織特異性基因表達的可逆過程［32］。生理狀態的DNA甲基化在細胞分化、基因表達［33］、胚胎發育［34］、生長、遺傳［35］、免疫調節［36］、衰老［37］等過程中起著重要作用，而異常的DNA甲基化與多種疾病的發生、發展密切相關［38］。DNMTs在哺乳動物中主要是DNMT1、DNMT3a和DNMT3b：DNMT3a和DNMT3b的主要作用是從頭合成DNA甲基化；DNMT1的主要作用是維持DNA甲基化，負責維持分裂過程中子細胞基因組的DNA甲基化模式［39-40］。

2.2 HPC與DNA甲基化已有證據顯示DNA甲基化廣泛參與了HPC的內源性保護作用［8］。在研究HPC小鼠海馬組織中DNMTs的表達和活力時發現，與正常小鼠相比，HPC小鼠的DNMT3a和DNMT3b表達降低，而DNMT1的表達則不受影響［41］。在胚胎期神經元遷移和定位的研究中得出，HPC可以降低DNMTs活性而使RELN基因（reelin的基因）啟動子區CpG島位點甲基化水平發生不同程度降低，進而促進RELN基因的表達，提高小鼠的空間學習記憶能力［42］。有研究表明，HPC可以通過下調DNMTs表達激活外泌體microRNA-126的表達，提高神經元的低氧/缺血耐受性［8］。有研究證實，HPC可以上調多種腦內神經保護性基因的表達并廣泛去DNA甲基化，通過啟動基因表達和蛋白質合成而增加神經元對低氧/缺血的耐受性，為腦卒中提供新的治療策略［43］。在移植心臟祖細胞治療充血性心力衰竭的研究中觀察到，HPC還能通過激活PI3K-Akt途徑上調DNMT1和DNMT3b活性，抑制p53基因表達，且不會使p53基因啟動子超甲基化；能增強心臟祖細胞的抗凋亡能力并提高其生存率［44］。總之，HPC上調“好基因”表達或下調“壞基因”表達的內源性神經保護機制，很可能是通過雙向調控靶基因的甲基化水平來實現的。

3 HPC條件下的DNA甲基化及其對BDNF和Trk B的調控

3.1 DNA甲基化對BDNF和TrkB的調控BDNF和TrkB在突觸可塑性和學習記憶中的作用已經被證實是不可或缺的［16］，而最新研究發現DNA甲基化可以通過調控BDNF表達來影響學習記憶［45］。在大鼠海馬神經元中，DNA甲基化水平顯著降低，伴隨BDNF基因表達上調，同時大鼠的學習能力也明顯提升［46］。還有研究指出，DNMT抑制劑RG108可以在短時間內增加BDNF表達量，而且伴隨著基因啟動子中特定CPG島甲基化的增加，可以增強神經元的突觸可塑性，提高認知能力［47］。一部分腦卒中患者會同時患有焦慮障礙，而腦卒中患者BDNF基因的高甲基化則與焦慮有關；BDNF作為卒中后焦慮障礙的易感性標靶，應受到密切監測，以明確焦慮是否發生，特別是在卒中恢復期［48］。還有研究表明，纈氨酸可以降低小鼠海馬中DNA甲基化水平，并且上調TrkB表達，從而發揮其抗抑郁樣作用［49］。應激可引起大鼠行為異常，并伴有BDNF外顯子IV啟動子區甲基化增加，引起海馬中BDNF表達降低［50］。除了在神經系統，DNA甲基化對TrkB的調節還表現在腫瘤方面。肝癌的發病可能與TrkB基因啟動子的高度甲基化有關，TrkB上調可能促進腫瘤的侵襲和轉移［51］。另有研究顯示，慢性疲勞綜合征患者BDNF蛋白水平較高，但BDNF基因甲基化水平較低，可能與患者痛覺過敏有關［52］。以上實驗結果表明，在一些神經疾病和精神疾病的治療過程中，抑制DNA甲基化可以使BDNF和TrkB的表達升高而發揮神經保護作用，從而產生良好的預后。

3.2 HPC條件下DNA甲基化對BDNF和TrkB的調節在HPC條件下，DNA甲基化對BDNF和TrkB表達調控的研究比較少。對精神分裂癥的研究表明，低氧會使BDNF的甲基化水平升高，導致學習記憶能力下降；低氧還會讓前額葉的DNA甲基化水平降低，造成前額葉活動度降低，這可能是造成精神分裂癥的原因［53］。然而HPC的神經保護作用是明確的，我們正在進行的研究顯示，HPC可顯著提升小鼠的學習記憶能力，而BDNF和TrkB及其信號通路與學習記憶能力密切相關。有趣的是，我們同時發現HPC條件下BDNF的表達水平也顯著升高，因此BDNF很可能參與了HPC改善小鼠學習記憶的過程。此外，HPC可降低DNMT3a和DNMT3b的表達，同時在BDNF啟動子區域有大量CpG島，HPC狀態下這些CpG島的甲基化水平降低。因此，DNA甲基化可能是HPC上調BDNF表達的機制，HPC可能通過降低BDNF啟動子區域的甲基化水平上調BDNF表達，從而提升小鼠的學習記憶能力。后續的研究將要通過注射DNMT抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷從側面驗證我們的推測。此外，BDNF/TrkB信號通路及其及其下游途徑是如何參與HPC提升小鼠學習記憶的過程中，也是我們下一步研究的重點內容。