25-羥基膽固醇的免疫調控作用及其對結核肉芽腫形成的意義①

周 爽 李 丹 宋璟瑞 聞 馨 杜德兵 王德成

（三峽大學醫學院，三峽大學感染與炎癥損傷研究所，宜昌443002）

1 概述

膽固醇在人體中具有多種生理功能，不僅參與細胞膜形成，還是合成膽汁酸、維生素D及甾體激素的原料。在脂質脫氫酶和氧化酶的催化下，膽固醇環或側鏈上添加羥基形成一系列氧化衍生物，稱為氧固醇。早期認為氧固醇的代謝只是一種簡單的生物轉化，增加極性，利于體內消除；上世紀90年代以來，通過對動脈粥樣硬化（atherosclerosis，ATH）的深入研究，發現內含大量氧固醇，從而引起研究者對氧固醇的重視［1］。后來發現，氧固醇也是孕烯醇酮和甾體激素合成的中間體，且其還能與特定的受體相互作用，識別信號通路［2］。近年發現，氧化的膽固醇比未氧化的膽固醇更有助于免疫反應［3］。25HC（25-hydroxycholesterol，25HC）屬于眾多膽固醇氧化物中的內源性氧固醇，是巨噬細胞產生并分泌的唯一氧固醇，其在不同生物學過程中發揮重要免疫作用，包括抗病毒效應、調節炎癥反應、信號轉導等［4］。CH25H（cholesterol 25-hydroxylase）是一種干擾素刺激基因的表達產物，是一種內質網相關酶，可催化膽固醇生成25HC［5］。體內與體外研究發現，結核感染時細胞內CH25H∕25HC通路異常高表達［6-7］。結核患者肉芽腫區域存在豐富的泡沫細胞，且最近一項研究發現，體內或體外25HC均能誘導泡沫細胞產生［8-9］。提示25HC可能介導泡沫細胞參與肉芽腫的形成，而CH25H∕25HC通路在結核肉芽腫中的作用目前未見報道。因此本文將討論25HC的免疫作用的進展，并重點討論25HC在結核肉芽腫形成過程的作用。

2 25HC的免疫調控作用

2.1 25HC的抗病毒效應 25HC具有明顯的抗病毒效應，但其作用機制目前尚無定論。病毒感染會刺激細胞產生干擾素（interferons，IFNs），Ⅰ型和Ⅱ型IFNs能夠上調CH25H蛋白表達，CH25H主要通過其催化產物25HC來抵抗病毒入侵。Zika病毒感染細胞后，細胞內CH25H和25HC的水平顯著上調，25HC插入到病毒感染的細胞膜，降低細胞膜流動性，阻斷病毒介導的細胞之間的膜融合，抑制病毒進入細胞［10］。研究顯示，過表達CH25H或用25HC處理細胞可抑制包膜病毒的復制，包括埃博拉、艾滋病病毒、水皰性口炎病毒及鼠皰疹病毒68等［11］。也有研究者認為，25HC是通過影響蛋白質復制、對其進行化學修飾，從而阻止病毒復制［12］。CH25H抵抗拉沙熱病毒的機制，便是通過影響GP1蛋白的糖基化來阻礙病毒與宿主受體的吸附，從而抑制病毒的入侵［13］。此外，氧固醇還可能激活綜合應激反應，這種反應會激活轉錄重組，抑制蛋白質合成，從而抑制病毒復制［14］。最新研究發現，豬繁殖和呼吸障礙綜合癥病毒還能通過泛素-蛋白酶體途徑降解CH25H，進一步說明CH25H∕25HC具有重要的抗病毒作用［15］。

2.2 25HC調節炎癥反應 炎癥是十分常見的基本病理過程，抗炎和促炎因子維持平衡才能使機體既有效抵御致病因素的侵襲，又使炎癥反應不至于過度強烈而損傷機體正常功能。在Toll樣受體的配體和Ⅰ型IFNs刺激下，巨噬細胞和樹突狀細胞均可表達大量的CH25H；CH25H可抑制B細胞中IgA產生，也可誘導巨噬細胞中促存活因子表達而促進胞內細菌生長［16］。缺乏CH25H表達的巨噬細胞則會分泌更多的IL-1家族細胞因子［5］。25HC還能通過阻斷固醇調節響應元件結合蛋白的激活，抑制炎性體活動和后續的IL-1β的產生［5］。

研究發現慢性阻塞性肺疾病患者痰液中25HC的表達水平增加［17］；25HC能增加核因子κB的DNA結合活性，最終導致IL-8和IL-6釋放增多［18］。用25HC處理小鼠巨噬細胞時，趨化因子CCL5在培養基中呈劑量依賴性釋放［19］。25HC還是一種與整合素生理相關的激活因子，參與調節炎癥反應［20］。此外，缺乏25HC的小鼠因其炎癥病理損傷減輕導致存活率增加，證實25HC具有放大炎癥信號的作用［21］。以上結果表明，25HC的炎性調節作用比較復雜，其既能促進炎癥發生，也能抑制炎性損傷，提示其在炎癥反應調節中的精細與微妙作用。

2.3 25HC參與信號轉導 25HC是高效的肝X受體（liver X receptor，LXR）的配體，能激活LXR［22-23］。25HC能通過LXR增加膽固醇逆向轉運體ATP結合轉運體A1和ATP結合轉運體G的活性，抑制巨噬細胞和其他外周細胞中的膽固醇積累［24］。研究發現，25HC通過糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）信號通路介導了血管緊張素Ⅱ誘導的肌肉萎縮，小鼠腹腔注射25HC后，肌肉萎縮素1和肌肉特異性環指蛋白1的表達上升，并抑制了IGF-1∕Akt信號通路，激活了GSK3β信號通路［25］。最近一項研究發現，對氧化固醇結合蛋白2的抑制顯著增加25HC的水平，25HC通過p53∕SREBF2∕NFYA信號傳導途徑也能下調氧化固醇結合蛋白2的表達［26］。此外，25HC經過CYP7B1催化后的產物7α，25-二羥基膽固醇（7α，25-dihydroxycholesterol，7α-25HC），是EB病毒誘導受體2（Epstein-Barr virus induced receptor 2，EBI2）的強效配體，而EBI2∕氧甾酮信號通路對適應性免疫反應非常重要［27］。EBI2在維持B細胞準確定位中具有舉足輕重的作用，僅毫微摩爾的7α-25HC即可使激活的B細胞產生強烈的遷移反應［28］。此外，7α-25HC與EBI2的相互作用還能促進激活的CD4+T細胞遷移到炎癥組織［29］。雖然7α-25HC是否只能由25HC生成尚不明確，但目前發現其只能在有25HC的區域生成［30］。

3 25HC促進泡沫細胞的形成

泡沫細胞是含有豐富脂質的巨噬細胞，巨噬細胞對死亡細胞及病原體的清除吞噬使巨噬細胞中含有大量的膽固醇等脂質，豐富的膽固醇會刺激乙酰輔酶A膽固醇酰基轉移酶，形成膽固醇酯，以脂滴的形式在細胞質中儲存［31］。在Toll樣受體的激活，及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和單核細胞趨化因子CCL2等促炎因子的持續刺激下，巨噬細胞通過調節血清中低密度脂蛋白顆粒的流入和流出間的平衡轉化為泡沫細胞［32-33］。泡沫細胞最常見于ATH，膽固醇在動脈內膜沉積，泡沫細胞在血管中出現。人體中氧固醇與ATH的形成密切相關，ATH斑塊中含有大量的泡沫細胞和氧固醇，包括25HC；而激活轉錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）通過與ch25h基因的啟動子直接結合，抑制ch25h的轉錄與表達，導致泡沫細胞生成減少［9］。以上結果證實，25HC能誘導泡沫細胞生成。SOTTERO等［34］證實25HC能誘導IL-8及多種細胞因子的產生，最終導致ATH形成。在ATH病理過程中，泡沫細胞的形成在很大程度上是由25HC介導的。神奇的是，LATHE等［35］發現阿爾茲海默癥與血管粥樣硬化這兩種看似毫無關系的疾病竟有緊密聯系。與ATH患者病變相似，阿爾茲海默癥患者大腦內血管壁明顯增厚，氧固醇、膽固醇前體和類固醇含量增多，并在大腦神經元發生退化區域測得高表達的Ch25hmRNA，提示此處高表達的Ch25hmRNA與增厚的血管壁可能密切相關。

越來越多的研究發現，與ATH巨噬細胞中脂質的漸進式積累與轉化相似，結核患者肺肉芽腫的脂質含量比未感染的肺組織明顯增加，結核肉芽腫內存在大量泡沫細胞［36］。研究報道，結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染可導致小鼠泡沫巨噬細胞內Ch25h轉錄水平和蛋白質水平均升高，且CH25H可使膽固醇脂質含量增加，促進MTB在巨噬細胞內的生存［37］。目前認為，25HC通過抑制膽固醇酯的水解，減少細胞內游離膽固醇的形成，抑制低密度脂蛋白受體的表達，促進泡沫細胞的形成［38］。25HC促進泡沫細胞生成的詳細機制還有待進一步深入研究。

4 25HC介導泡沫細胞參與結核性肉芽腫形成

4.1 泡沫細胞參與結核性肉芽腫形成 肺結核由MTB引起，經呼吸道傳播，結核病作為嚴重危害人類健康的慢性傳染病，治療效果卻并不理想。結核從潛伏期、亞臨床感染發展為活動性疾病，最終導致感染性桿菌的傳播，這一過程可從肉芽腫水平來局部地確定病情進展。因此，了解肉芽腫的形成過程，對了解感染的進展演變至關重要。結核性肉芽腫是細菌與宿主感染部位的細胞局部相互作用的結果，意味著免疫系統對感染的抑制，這是一個“僵持”的時期，在此期間，細菌的數量保持相對穩定，主要是一群非復制狀態的桿菌維持在“潛伏期”。肉芽腫對病灶既可進行局部滅菌，也可形成局部壞死，液化形成空洞導致感染性細菌在呼吸道擴散。小鼠感染結核菌后，早期的肺組織沒有任何損傷，組織反應相對穩定，但上皮細胞和固有層之間的細胞數目增加［39-40］。沒有細菌細胞壁或細菌基因組等碎片堆積，表明細菌數量仍然相對穩定［41］。當易感宿主吸入結核桿菌，肺泡巨噬細胞就會將其吞噬并激活，激活后的巨噬細胞釋放TNF、炎癥因子和趨化因子，肉芽腫的形成需要持續的TNF信號傳導來維持細胞招募和趨化因子濃度［42-43］。巨噬細胞、樹突細胞和淋巴細胞進入感染部位，隨后巨噬細胞分化成幾種不同的形態，包括多核巨細胞、上皮樣細胞和充滿脂滴的泡沫巨噬細胞［44］；接著結構更加分層，泡沫細胞進一步增多，成纖維細胞等圍繞在巨噬細胞層外，并將淋巴細胞排除在外，形成一個多細胞聚集的慢性炎癥區域，繼而發展為泡沫細胞豐富的肉芽腫［45］。

在MTB感染初期，巨噬細胞內的吞噬體內有多個桿菌，稱其為早期脂質體［46］。當感染的巨噬細胞慢慢出現在肉芽腫周圍時，早期脂質體形態發生變化，慢慢失去了甲苯胺藍染色陽性的特性，這種失去染色陽性的脂質體的出現即標志著泡沫細胞生成［46］。結核性肉芽腫的一個顯著特點是吞噬細菌的巨噬細胞分化為脂質豐富的泡沫細胞。脂質是胞內MTB生長所必需的，其在肉芽腫微環境下能夠利用的營養有限，因此脂質豐富的泡沫細胞則成為保證細菌生長的重要物質。將膽固醇用放射性碳（C14）標記追蹤，發現環上的碳轉化為二氧化碳（CO2），而側鏈上的26位碳被MTB吸收到其膜脂中，包括細胞壁上一種叫作PDIM（phthiocerol dimycocerosates）的脂質成分［47］。這證明泡沫細胞對MTB在肉芽腫中的生存有重要作用。肉芽腫內泡沫細胞位于肉芽腫中干酪樣壞死中心與淋巴細胞的交界處，緊密圍繞在壞死中心周圍［48］；而干酪樣壞死組織成分主要為膽固醇、膽固醇酯及磷脂等，與泡沫細胞中的脂質成分基本一致［49］。泡沫細胞在肉芽腫內的位置及其胞內脂質成分，都證明泡沫細胞在肉芽腫形成及發展過程中發揮重要作用。

4.2 25HC介導泡沫細胞參與結核性肉芽腫形成CD4+T細胞是MTB感染的關鍵免疫調節細胞，結核感染患者與健康對照者相比，其CD4+T細胞內CH25H表達顯著增高，25HC含量也明顯增加，而且在活動性肺結核患者體內升高更明顯［50］。體外研究顯示，減毒菌株（細胞壁有缺陷）與野生型MTB感染的巨噬細胞內CH25H表達水平都明顯增高，25HC含量也顯著增加，尤其是野生型MTB［7］。以上結果顯示，結核感染時免疫細胞內CH25H∕25H通路在體內體外均表現為異常高表達。肉芽腫是MTB感染后形成的特征性標志物，也是結核病理診斷標志物。大量研究證實泡沫細胞參與肉芽腫形成的全過程，為細菌提供碳源，并成為細菌抵御外界不良因素的屏障，保障細菌在肉芽腫內穩定的生存。泡沫巨噬細胞保證細菌的持續感染，介導肉芽腫形成的關鍵。因此，在結核感染期間發生的巨噬細胞脂質代謝改變可能與感染進展有關，通過減少泡沫細胞的生成，可能有助于控制肉芽腫的形成。以上結果提示，25HC可能通過介導泡沫細胞參與肉芽腫的形成，其具體作用機制還有有待進一步研究。

5 總結與展望

結核病是一種慢性消耗性疾病，是一種特殊的炎癥，目前治療結核病的宿主導向療法旨在達到最大限度殺死細菌的同時，盡可能減少炎癥所致組織損傷［51］。MTB感染宿主后，生成大量泡沫細胞，泡沫細胞不僅為結核菌提供營養和能量，還能助其抵御外界不良環境，保證結核菌在肉芽腫內的潛伏和持久性。因此，可通過抑制泡沫細胞的生成抑制MTB生長。實際上，在結核病治療最新進展中，已有研究表明，他汀類藥物（降脂類藥物，可減少分枝桿菌形成的脂滴）與標準方案聯用能加快小鼠肺部細菌的清除速度［52］。肉芽腫能保護機體，控制MTB感染，限制細菌在體內播散。面對環境變化時，肉芽腫中心壞死液化，細菌再活化并傳播。那么是否可以通過對肉芽腫進展的把握來控制結核病情的進展，并進行診斷治療？通過調控CH25H∕25HC介導泡沫細胞參與肉芽腫的形成，將有助于為研究結核病發病機制提供新線索，發展迫切需要的新的抗結核感染的治療方法，以及提供新的有效的臨床診斷標準。然而，25HC參與結核性肉芽腫形成的機制仍需深入研究。