β-葡聚糖引起的訓練免疫和LPS引起的免疫耐受在表觀遺傳和代謝水平的異同①

花 晴 申雪芳 許平波（復旦大學附屬腫瘤醫院麻醉科，上海 200032）

膿毒癥是機體對炎癥反應失調導致的嚴重威脅生命的多器官功能損害，其本質在于免疫調節紊亂。一方面，過度的免疫反應可引起臟器功能損傷；另一方面，全身性免疫抑制可導致細胞因子缺乏，使機體存活的免疫細胞不能進行有效的克隆增殖，進而對病原體產生有效的免疫應答而形成免疫耐受［1］。目前，早期膿毒癥的死亡率逐漸降低，而因過度炎癥反應或免疫耐受所致的二次感染是膿毒癥患者死亡的主要原因，使研究聚焦在膿毒癥導致的免疫改變上［2］。傳統觀點認為，免疫反應可分為固有免疫反應和適應性免疫反應，與前者相比，后者反應慢但更具特異性，且可產生免疫記憶。現有研究證實，在炎癥感染或接種疫苗后，固有免疫細胞如單核細胞可因表觀遺傳改變而產生固有免疫記憶，當病原體再次入侵時產生一種更加強烈的固有免疫反應，稱為固有免疫記憶或訓練免疫（trained immunity，TI）［3］。臨床試驗和動物實驗研究表明，膿毒癥后免疫耐受的形成并不可簡單歸納為某一特定通路受模式識別受體（pattern recogni?tion receptor，PRR）的影響無法激活下游基因，而是其自身染色質和轉錄因子發生改變進而導致耐受基因形成，使其在表觀遺傳和代謝水平均發生改變［4］。

單核細胞是骨髓細胞和組織巨噬細胞的中間體，是固有免疫系統的重要組成部分［5］。當機體受病原體入侵時，單核細胞迅速趨向病原體，并分化為巨噬細胞來清除病原體，恢復組織完整性［6］。單核細胞及由單核細胞分化而來的巨噬細胞的功能表型取決于感染后免疫系統的功能狀態，即免疫耐受或TI［7］。在膿毒癥最初發生的數小時內，固有細胞免疫耐受可保護機體免受過激的炎癥反應影響［8］。而持續的免疫耐受可使機體進入一種“免疫麻痹”狀態，單核/巨噬細胞表現為促炎癥因子分泌減少或基本不分泌，人體白細胞抗原DR（human leu?kocyte antigen DR，HLA-DR）表達下降，單核細胞誘導的抗原特異性T淋巴細胞活性降低，單核細胞釋放多種細胞因子能力的改變，多形核白細胞無反應性［9-11］。而特定感染如卡介苗注射等可延長單核細胞的作用時間并在病原體二次入侵時產生更加強烈的固有免疫反應，即TI［12-15］。本文將圍繞脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）引起的免疫耐受和β-葡聚糖引起的TI在表觀遺傳學和代謝方面的異同展開，以期為臨床治療膿毒癥后免疫耐受提供幫助。

1 引起TI或免疫耐受的表觀遺傳學改變

1.1 LPS或BG介導的組蛋白表觀遺傳修飾 表觀遺傳學是指在基因的DNA序列沒有發生改變的情況下，基因功能發生了可遺傳的變化，并最終導致表型的變化。LPS產生的免疫耐受與β-葡聚糖（βglucan，BG）引起的TI均與特定的表觀遺傳狀態密切相關［16-17］。近期研究表明，在真核細胞染色質中，組蛋白第三亞基4號賴氨酸的表觀遺傳修飾在免疫記憶和免疫耐受過程中發揮重要作用，其三甲基化水平（histone 3 lysine 4 methylation3，H3K4me3）能夠有效調控基因沉默和發育；而組蛋白第三亞基27號賴氨酸的乙酰化水平（histone 3 lysine 27 acetyla?tion，H3K27ac）則通過調控增強子和啟動子的激活進一步調控真核細胞的基因轉錄［18］。真核細胞轉錄調控的實現，主要依賴于轉錄因子（transcription factors，TFs）和轉錄因子結合位點（transcription fac?tor binding sites，TFBSs）的相互作用。二者結合后可構成轉錄因子結合模體（transcription factor bind?ing motifs，TFBMs），進而調控真核細胞的基因轉錄［19-20］。

有研究表明，缺乏T細胞和B細胞的小鼠在受到白色念珠菌二次感染時，BG會通過C型凝集素受體（dectin-1）和Raf-1-依賴性通路引起單核細胞的功能重塑，促進其釋放細胞因子增多，成為抵御病原體的主體［21］。單核細胞的上述功能改變與穩定的組蛋白H3K4三甲基化改變有關，說明TI的形成與表觀遺傳改變，特別是組蛋白的改變密切相關。SAEED［16］等將從健康志愿者外周血中提取的單核細胞分別給予BG和LPS刺激以形成TI和免疫耐受。對組蛋白標記H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac和脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ）進行表觀基因分析發現，在單核細胞分化為巨噬細胞的過程中，TI細胞中表達代謝相關酶及炎癥因子的基因增多，而免疫耐受細胞中這些基因表達減少；約12%的TFs參與調節免疫耐受和TI的形成，且在特定動態表觀區的DNaseⅠ超敏位點發現了TFBMs，說明免疫耐受和訓練記憶的表觀遺傳改變需要特定的TFs。有研究將單核細胞分別暴露于LPS和BG中24 h，再培養5 d后進行表觀遺傳學分析，結果發現：在3 200多個與脂質代謝、白細胞分化及溶酶體相關的增強子組成的區域中，與對照組相比，暴露于BG的單核細胞H3K27ac沉積較多，H3K4me1沉積也較多，并抑制了H3K27me3的沉積，H3K27ac的聚集與H3K4me1一致；而暴露于LPS的單核細胞幾乎無H3K27ac沉積，但H3K27me3沉積較多，且相應的H3K4me1沉積較少［22］。該研究表明，BG可促進巨噬細胞的吞噬作用和細胞因子釋放，而LPS則阻斷這一過程。上述研究均表明，LPS介導的免疫耐受和BG介導的TI均與特定的表觀遺傳修飾改變有關，且發生了相反的改變。

1.2 LPS或BG介導的轉錄組學改變 通過對單核細胞轉錄組學進行分析，發現約5 700個mRNA在LPS和BG暴露下發生了動態變化［22］。與對照組相比，BG刺激后可促進與脂質合成、代謝和溶酶體途徑有關的mRNA表達，如早期生長反應蛋白2（early growth response protein 2，EGR2）、巨噬細胞集落刺激因子1（CSF1）、溶酶體相關膜蛋白-1（LAMP1）、小眼畸形相關轉錄因子（MITF）等，單核細胞表達分化基因增快。與之相反，LPS刺激后，上述mRNA表達下調，單核細胞表達分化基因減慢，因而較少分化為巨噬細胞。提示BG刺激后可促進單核細胞分化為巨噬細胞，增強吞噬清除病原體的能力；而LPS刺激后，單核細胞產生免疫耐受，進而較少分化為巨噬細胞，抑制其吞噬功能。

2 調節免疫耐受和TI的代謝改變

2.1 EGR2免疫細胞代謝的改變可對早期細胞因子的釋放、免疫耐受的形成及最終形成免疫麻痹產生重要影響［23-26］。EGR2是BG受體dictin-1的下游分子，其修飾的增強子主要與脂質代謝有關［27］。將人體外周血單核細胞（peripheral blood monocytes，PBMC）分別暴露于BG和LPS中24 h，靜置5 d后發現，暴露于BG的單核細胞可短暫激活EGR2，EGR2的表達量升高，H3K27ac在相關增強子中沉積增多，相應的下游脂質代謝基因表達升高；而暴露于LPS的單核細胞并未發現有類似的作用，其下游代謝基因表達較低［22］。提示BG/dectin-1引起的EGR2激活可促進下游轉錄因子高表達，上調與脂質代謝相關基因的啟動子和增強子表達。而這些轉錄因子在LPS暴露的單核細胞中不表達，說明暴露于LPS的單核細胞無法激活與脂質代謝相關的特異性下游通路。綜上，dictin-1-EGR2通路在免疫訓練和免疫耐受的單核細胞中的表達截然相反，說明其可能與TI或免疫耐受的形成有關，且在其中發揮完全相反的作用。

2.2 mTOR通過對BG引起的TI細胞進行轉錄組分析發現，在基因組蛋白修飾過程中，除了脂質代謝通路改變，其他重要細胞代謝通路如葡萄糖也發生了重要改變［28-30］。BG誘導的TI細胞有氧糖酵解增強，基礎呼吸效率降低，葡萄糖消耗增多，乳酸形成增多。提高的糖酵解水平可調控組蛋白的甲基化和乙酰化，作為BG引起TI的代謝學基礎。

雷帕霉素靶向基因（mammalian target of rapa?mycin，mTOR）的表達在BG或LPS引起的免疫改變過程中均發揮巨大的作用。有研究表明，mTOR-缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α，mTOR-HIF-1α）通路對BG引起的TI細胞糖代謝改變至關重要。阻斷mTOR-HIF-1α通路可抑制TI形成。給予小鼠mTOR抑制劑或敲除小鼠的HIF-1α，則無法產生TI以應對病原體的二次入侵［17］。還有研究表明，LPS引起的免疫耐受中也發現了mTOR表達的改變。mTOR對巨噬細胞的吞噬作用和極化均有重要作用［31-32］。M1型巨噬細胞可分泌大量細胞因子，激活機體免疫反應，促進炎癥反應；而M2型巨噬細胞具有抗炎、抑制細胞因子釋放、抑制免疫應答的作用［33］。激活mTOR可促進巨噬細胞極化為M2型。給予mTOR抑制劑雷帕霉素后，巨噬細胞主要極化為M1型。由此說明，在TI和免疫耐受中，這些看似無特殊作用的代謝產物可通過改變基因相關酶的活性來修飾表觀遺傳。

2.3 衣康酸鹽 衣康酸鹽是三羧酸循環（tricarbox?ylic acid cycle，TCA）中順烏頭酸在免疫反應基因1（immune-responsive gene 1，IRG1）的調節下由烏頭酸脫氫酶1（aconitate decarboxylase 1，Acod1）催化產生。膿毒癥時，髓樣細胞急劇激活可導致衣康酸鹽大量產生，進而介導人單核細胞產生固有免疫耐受［34-36］。

大量研究成果表明，衣康酸鹽作為主要代謝產物，通過調節琥珀酸脫氫酶（succinate dehydroge?nase，SDH）的表達以及TCA循環體在LPS或BG介導的免疫改變過程中發揮巨大作用［37-39］。LPS刺激后，衣康酸鹽是巨噬細胞中上調最明顯的代謝產物。巨噬細胞內急劇升高的衣康酸鹽一方面可抑制SDH，調節琥珀酸和延胡索酸水平，抵消琥珀酸的促炎作用；另一方面可激活Nrf2，上調抗炎抗氧化基因表達，抑制炎癥基因表達，抑制細胞因子IL-1β、IL-18、IL-6、IL-12、NO和HIF-1α表達，進而產生抗炎作用，介導單核/巨噬細胞產生免疫耐受［40］。而BG引起的TI可通過下調IRG1表達，上調SD的表達，進而抑制衣康酸鹽的產生，恢復TCA循環，使機體面對二次感染時產生更強的固有免疫反應。為進一步探究其表觀遺傳改變，將PBMC分別給予LPS或BG刺激后，研究者們通過檢測H3K27ac水平發現，LPS可引起IRG1周圍大量的H3K27乙酰化。且H3K27ac的動態變化與IRG1的高表達曲線一致。當受到LPS和BG混合刺激或在LPS刺激前暴露于BG，巨噬細胞IRG1含量僅輕度升高，說明BG可抑制LPS引起的IRG1高表達，進而阻斷衣康酸鹽的形成。LPS刺激后4 h細胞處于耐受狀態，SDH表達下調，進而影響琥珀酸和延胡索酸間的代謝轉換，阻斷琥珀酸激活的促炎通路，影響體外單核細胞分化。而在LPS刺激后給予BG可恢復SDH表達的上調。即BG可逆轉LPS導致的單核細胞SDH表達下調，恢復SDH表達［41］。由此可知，IRG1-衣康酸鹽-SDH軸在LPS引起的單核細胞免疫耐受中發揮重要作用，BG或可逆轉LPS造成的免疫耐受。

3 BG可逆轉膿毒癥后免疫耐受

BG和LPS暴露對組蛋白標記H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac在目標啟動子和增強子的沉積、轉錄組的變化、EGR2及下游轉錄因子表達、mTORHIF-1α通路的激活、TCA中衣康酸鹽的產生有完全相反的影響，進而對與單核/巨噬細胞功能有關的基因的表達、代謝通路如糖代謝及細胞因子的產生發生截然不同的調節，提示BG或可逆轉免疫耐受。將單核細胞暴露于LPS 24 h誘發免疫耐受后再暴露于BG 24 h，經歷一段不打擾時間后再次暴露于LPS，探索BG對LPS誘發的免疫耐受的作用。結果發現，LPS耐受后給予BG可恢復約60%的耐受基因表達，包括一些促炎的TFs，部分恢復單核細胞釋放細胞因子的水平［16］。為進一步確定其療效，在人體實驗中，健康志愿者注射LPS后4 h，關鍵細胞因子如IL-6和TNF-α的mRNA表達增多，細胞因子釋放增多。抽取志愿者外周血，再次暴露于LPS，則無細胞因子釋放［22］。說明單核細胞產生了耐受。而事先給予BG，可恢復炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，解除單核細胞的耐受。上述研究在細胞和人體水平證明了，LPS在體內外引起耐受的機制相同，BG逆轉LPS引起的免疫耐受的潛能或可被推廣到臨床。

4 展望

膿毒癥的死亡率在30%～50%，且因耐藥性嚴重、老年人口增多和免疫抑制的發生率升高，膿毒癥的死亡率也逐年升高［42］。如何逆轉膿毒癥后的免疫耐受成了國內外研究的熱點。

表觀遺傳學分析發現，早期暴露于病原體時，免疫耐受和TI可對常見通路如IRG1-衣康酸鹽-SDH軸產生完全相反的調節，產生不同的表觀遺傳改變，形成不同的巨噬細胞表型和免疫功能狀態。免疫耐受表現為低免疫反應狀態，而TI表現為高免疫反應，產生更多的細胞因子。鑒于二者存在相反的表觀遺傳改變和單核/巨噬細胞功能狀態，研究者或許可將BG引起的TI作為治療免疫耐受靶點。近年來，DNA剪切技術的飛速發展也為研究者明確對BG反應最明顯的轉錄因子、表觀遺傳因子和DNA甲基化片段提供了幫助。為研究者確定治療靶點，盡快將BG應用于臨床提供助力。除了免疫耐受的研究，也可將BG引起的TI用于其他臨床疾病，如腫瘤、自身免疫疾病和自身炎癥反應等。

免疫領域還有很多問題值得深思。研究者需要進一步闡述影響TI和免疫耐受的代謝和表觀遺傳過程，探討TI和免疫耐受之間的復雜關系。隨著科學的進展，BG引起的訓練免疫和LPS引起的免疫耐受的具體機制正在被逐步明確，單核細胞作為固有免疫的重要組成部分，與免疫耐受和TI密切相關，但其他固有免疫成分，如補體系統、溶菌酶是否也會在TI和免疫耐受的代謝和表觀遺傳過程中發揮作用，TI和免疫耐受之間依靠哪些機制相互調節轉換等問題都需要進一步探究。