Cyclophilin A在病毒感染中的作用研究進展①

岳巖磊 張穩穩 張夢豪 劉 薇（河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002）

Cyclophilin A（CypA）為Cyclophilin家族成員，具有順反異構酶活性，是一個高度保守并廣泛存在的蛋白質。在人體內已發現有16個Cyclophilin家族成員，包括CypA、CypB、CypC、CypD、Cyp33、Cyp40，其中CypA和Cyp40主要定位于細胞質，CypB和CypC主要定位于內質網，CypD可直接與線粒體膜蛋白結合定位于線粒體，Cyp33的氨基酸末端含有RNA結合結構域，從而定位于細胞核［1］。

CypA是Cyclophilin家族中含量最多、細胞內分布最廣的蛋白，約占細胞內總蛋白質的0.4%。人CypA基因定位于染色體7p13，DNA片段全長2 276 bp，包含5個外顯子。CypA是一條含有165個氨基酸的多肽鏈，相對分子質量約為18 kD，其二級結構含有8條反向平行的β折疊，另一面由兩條α螺旋形成桶狀結構［1］。CypA是第一個從小牛胸腺分離出的免疫抑制劑環孢素A（Cyclosporin，CsA）的宿主細胞受體，因此被認為是一種重要的免疫因子［2］。CypA和CsA的復合物能夠抑制鈣調神經磷酸酶的活性，進而抑制T細胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）的去磷酸化，使其不能從細胞質向細胞核轉移，從而影響下游基因活化，起到免疫抑制作用［3］。

作為Cyclophilin家族的重要成員，CypA也具有順反異構酶活性，其機制是催化中心的電子層和脯氨酸殘基的羰基基團改變了催化中心的偶極，這種變化導致兩個氨基酸殘基間肽鍵的旋轉，從而使底物發生順式和反式的變化［4］。最近發現CypA的順反異構酶活性還具有其他功能，包括調控信號轉導、分子伴侶、RNA加工、細胞凋亡、免疫應答等過程［5-6］。隨著對CypA研究的深入，發現CypA還參與許多病毒的復制，且具有促進病毒復制的作用，如HIV-1、HBV等［7］。然而，CypA在流感等病毒的復制過程中卻具有抑制作用［8］。

1 CypA在人類免疫缺陷病毒（human immu-nodeficiency virus，HIV）感染中的作用

HIV是反轉錄病毒，該病毒感染人類后可破壞人體免疫系統，導致人類獲得性免疫缺乏綜合癥（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）的發病。人CypA可與HIV-1病毒結合并摻入病毒顆粒，參與HIV-1的病毒復制、脫殼等過程［9］。最初發現這一過程與HIV-1的多聚蛋白Gag結合相關，其通過與Gag前體（Pr55gag）的CA功能域相互作用影響病毒粒子的組裝，尤其是第89位甘氨酸和第90位脯氨酸，而第25位丙氨酸、第27位賴氨酸、第29位脯氨酸和第30位賴氨酸位點突變后并未影響CypA與CA的互作［10-11］。抑制CypA和CA的結合時，HIV-1病毒的逆轉錄及cDNA的入核也受到抑制［12］。隨后，GOLDSTONE等［13］證實CypA可與哺乳動物體內逆轉錄酶病毒限制因子Fv1結合形成融合蛋白Fv1CypA，而Fv1CypA能夠阻止CypA與CA的結合，從而降低HIV-1的感染力。CsA處理后，CA突變體N57A的傳染性明顯減弱，表明其傳染性依賴于CypA［14］。隨著研究的深入，發現核HIV-1 DNA的積累依賴于CypA，且CypA在非洲綠猴腎細胞Vero中抑制HIV-1的感染是通過逆轉錄病毒限制因子Trim5α結合到衣殼，然后阻斷HIV-1預整合復合物的核輸入過程［15］。

研究發現，HIV-1轉錄蛋白的反式激活因子Tat（trans-activator of transcription，Tat）入核能夠保證病毒基因的有效轉錄，大部分Tat由定位在質膜的磷脂酰肌醇4，5二磷酸PI（4，5）-P2招募而分泌到胞外，而Tat的棕櫚酰化能夠阻止Tat分泌。CHOPARD等［16］證實CypA促進HIV-1的Tat棕櫚酰化并在未感染HIV-1的細胞中大量積累，然而，由于病毒的出芽過程中Gag與CypA的結合消耗了Cy?pA，因此該過程特異性抑制Tat-棕櫚酰化。與HIV-1相似，HIV-2原代分離株衣殼介導的感染同樣需要CypA，且該過程也依賴于HIV-2與CypA的相互作用［17］。盡管CypA參與HIV復制過程的作用機制尚無定論，但CypA對HIV的復制是不可或缺的，由于CypA在HIV-1復制早期即發揮重要作用，因此其可能成為阻止HIV-1復制的藥物靶點。

2 CypA在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染中的作用

HCV屬于黃病毒科，是一種RNA病毒。與HIV-1相同，CypA在HCV病毒復制中發揮重要作用，CypA敲除細胞或用CsA處理的小鼠均可顯著抑 制HCV病 毒 復 制［18-19］。CsA處 理 細 胞 后 發 現HCV的復制受到抑制，證實CypA能夠抑制HCV RNA的 合成［20］。FOSTER等［21］證實CypA通 過與HCV的非結構蛋白5A（non-structural protein 5A，NS5A）的第二、第三個結構域結合催化NS5A，使NS5A更容易和HCV的正鏈RNA結合。此外，KAUL等［22］發現HCV-NS5A第二結構域上的兩個突變（D2229G、L2266F）和第三結構域上一個突變（V2440A）的復制都失去了對CypA的依賴性，并增加了對非免疫抑制的CsA類似物Alisporivir（ALV）的抵抗力。第二結構域中另外兩個突變（D320E、R318W）可能引起局部或整體折疊擾動，從而影響構象的變換，但并未影響CypA與第二結構域的相互作用［23］。另有報道證實，NS5A第二個結構域第314位的脯氨酸-色氨酸轉變對HCV復制及與CypA相互作用至關重要，這項工作為進一步探究HCVNS5A第二結構域內無序蛋白質提供了分子基礎［24］。CypA其他抑制劑SMCypI（small-molecule cy?clophilin inhibitor，SMCypI）、ALV和SCY-635通過與CypA競爭結合，抑制CypA的肽脯氨酰順反異構酶活性，進而破壞CypA與NS5A的相互作用，從而影響HCV的復制［25-26］。NAG等［27］證實CsA能夠影響HCV的極低密度脂蛋白（very low-density lipopro?tein，VLDL）合成途徑，導致脂質滴增大、載脂蛋白B在脂質滴上的積累，抑制感染病毒的裝配，提示CypA在脂質轉運和HCV發病機制中具有重要作用。

HOPKINS等［25］證實CypA還能與非結構蛋白5B（non-structural protein 5B，NS5B）相互作用。NS5B被CypA招募至病毒復制復合體，該過程可能有利于NS5B在病毒復制過程中構象的正確轉變，且依賴于CypA的順反異構酶活性。通過分解位點的點突變實驗表明，HCV的復制與CypA對NS5A-NS5B蛋白分解存在相關性，表明病毒多聚蛋白的裂解在一定程度上依賴于CypA［28］。在HCV感染過程中，CypA還參與調控干擾素（interferon，IFN）產生的信號通路，BOBARDT等［29］發現，CypA可通過其順反異構酶口袋與干擾素調節因子9（interferon regulatory factor 9，IRF9）的碳末端區域結合，誘導IFN產生；而NS5A可競爭性地與CypA結合，破壞CypA和IRF9復合物的形成。CypA抑制劑SCY-635能夠抑制雙鏈RNA依賴的蛋白質激酶PKR（protein kinase R，PKR）和真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）的磷酸化，促使干擾素誘導基因的表達受到抑制，由此，CypA在該通路可能成為開發治療丙肝病毒感染的新靶標［30］。在小鼠、樹鼩和七種非人類靈長類動物中研究CypA對HCV復制時發現，只有在鼠的穩定表達CypA細胞中拯救出HCV，提示CypA參與HCV復制存在種屬特異性［31］。隨著越來越多新的抗HCV藥物出現，包括直接抗病毒藥物DAA（direct-acting antiviral agents）和具有非病毒靶點的藥物（CypA抑制劑、IFN-λ、疫苗治療），HCV治療領域發生了巨大變化。鑒于這些藥物具有更高的安全性和抗病毒效力，其用于治療HCV的感染正在形成趨勢［32］。

3 CypA在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染中的作用

HBV是一種DNA病毒，目前發現只有人和猩猩對HBV有易感性，能夠引發乙型病毒性肝炎疾病。免疫共沉淀實驗結果證實了CypA與HBV的小乙型肝炎病毒表面抗原SHBs（small hepatitis B virus sur?face，SHBs）間的互作情況，而人肝癌細胞系中SHBs的表達能顯著促進CypA分泌。給小鼠注射HBVSHBs后，隨著小鼠炎癥浸潤程度的加劇，其血清中CypA水平也隨之增加，而使用CsA處理的炎癥應答反應與之相比較低［33］。動物實驗結果表明，HBV表面抗原陽性轉基因小鼠體內CypA蛋白水平有所下降，而過表達乙肝表面抗原HBsAg（hhepatitis B sur?face antigen，HBsAg）細胞的培養基上清中，可以檢測到高水平的CypA，提示HBsAg陽性細胞中的Cy?pA可能分泌至細胞上清［33］。利用Hex 8.0.0軟件進行分子對接，預測化合物HBF-0259與已知參與HBV組裝的細胞因子和HBsAg分泌因子之間的相互作用發現，HBF-0259與CypA間存在相互作用，并且參與HBsAg分泌及HBV整合過程［34］。此外，研究表明非免疫抑制劑ALV通過抑制肝細胞系中CypA的表達，進而抑制HBV的DNA復制及HBsAg的產生和分泌［35］。NKONGOLO等［36］發現CsA通過與鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白直接結合，并與介導病毒進入的前S1蛋白（preS1）結構域重疊，從而抑制HBV的進入，且CsA通過CypA發揮免疫抑制作用。共價閉合環狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）分子的清除是未來治療HBV的主要挑戰，因此，宿主分子如TLR7（Toll-like receptors 7，TLR7）和CypA已成為預防HBV侵入和復制的潛在靶點［37］。

4 CypA在流感病毒（influenza virus，IV）感染中的作用

流行性感冒病毒簡稱流感病毒，是一種造成人類及其他動物患流行性感冒的病毒。有報道證實CypA可被包裝到IV粒子中，早期研究發現，CypA既不影響病毒基因組的復制和轉錄，也不影響病毒mRNA的出核，但卻在IV復制的蛋白水平上有明顯抑制效果。例如，人的CypA可與IV的基質蛋白1（matrix protein 1，M1）中間結構域結合，通過影響新合成的M1蛋白入核，從而影響IV的早期復制。CsA在CypA缺失的情況下可抑制病毒mRNA的出核，而在CypA存在的情況下又可促進CypA和M1蛋白的結合進而影響病毒的復制［38］。CypA能夠通過泛素/蛋白酶體途徑促進M1蛋白的降解從而抑制IV的復制［39］。MAHESUTIHAN等［40］證實CypA可通過E3泛素連接酶AIP4（atrophin-1 interacting protein 4）介導M1的K102和K104位點泛素化調控M1蛋白穩定性。有趣的是，CypA對AIP4介導的M1以上兩個位點的泛素化還能抑制M1的出核過程，該結果進一步解釋了CypA對M1的出核調控及復制機制。XU等［41］發現雞的CypA同樣具有抑制IV復制的作用。此外，LIU等［42］證實CypA還能通過調控RIG-Ⅰ（reti?noic acid inducible gene-Ⅰ）介導的Ⅰ型IFN的產生抑制IV的復制。

5 CypA在其他病毒感染中的作用

在感染輪狀病毒（rotavirus，RV）的細胞中發現CypA與其非結構蛋白5（nonstructural protein 5，NSP5）存在共定位，說明CypA可能被招募到RV病毒粒子中，并且發現CypA能通過其順反異構酶活性抑制RV的復制［43］。HE等［44］證明CypA除了能夠與RV的結構蛋白VP2（viral protein 2）相互作用外，還能通過促進Ⅰ型IFN的產生抑制RV復制，此過程不依賴CypA的PPIase活性，而是依賴于CypA對JNK（c-Jun N-terminal kinase）信號通路的激活。黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）的復制同樣高度依賴宿主因子，YFV的非結構蛋白4B（non-structural protein 4B，NS4B）參與病毒的復制和免疫逃逸，通過GST pull-down和LC-MS/MS實驗證實CypA與NS4B間存在相互作用，進而調控YFV的復制［45］。人類冠狀病毒（human corona virus，HCoV）-NL63和HCoV-229E的復制也受CypA敲低或敲除的影響［46-47］。另外，CypA抑制劑CsA處理后能夠抑制多種CoV的復制［48］。WILDE等［48］通過對CsA等CypA抑制劑的研究發現，CypA是巢式病毒復制的宿主因子，多種冠狀病毒和動脈病毒的復制受極低濃度的CsA、ALV及NIM-811的抑制［47，49-50］。目前，ALV是臨床上最先進的廣譜抗病毒藥物，其通過靶向宿主蛋白CypA發揮作用。在組織培養中觀察到ALV對makona埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）表現出輕微的抗病毒作用，與許多其他對人類有致病性的病毒相比，EB?OV的復制不依賴于CypA［51］。研究發現，感染人巨細胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）后，CypA表達上調并向細胞外分泌，作為CypA胞外受體，CD147（cluster of differentiation 147，CD147）通過Cy?pA-CD147-ERK（extracellular regulated protein kinas?es）調控核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的激活及IFN-β的產生，從而介導抗病毒反應［52］。隨后，ABDULLAH等［53］發現CsA在HCMV發病機制中具有雙重作用，一方面，CsA可通過抑制T細胞功能參與病毒復制，另一方面，其還參與由反式激活因子IE2（immediate early 2）介導的抗巨細胞病毒作用，以上兩個過程中均有CypA參與。采用瞬時轉染過表達CypA的方法研究CypA對新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）復制增殖的影響時發現，CypA過表達可抑制NDV的復制和增殖，且NDV感染后CypA表達上調，說明在NDV感染過程中Cy?pA起負調節作用［54］。通過檢測110位因EB病毒（Epstein-barr virus，EBV）感染而患鼻咽癌的患者血清發現，CypA的mRNA和蛋白水平顯著高于正常人，提示CypA與鼻咽癌標志物EBV-VCA-IgA聯合分析將提高鼻咽癌的診斷準確度［55］。

6 總結與展望

體外研究表明許多DNA或RNA病毒感染宿主細胞后可誘導CypA表達，一方面，CypA可能通過蛋白質的折疊、信號轉導、炎癥等過程參與免疫應答，維持細胞穩態；另一方面，CypA在部分病毒的復制過程中與病毒蛋白互作，參與病毒入核及病毒復制等多個過程。

雖已證實CypA在病毒感染中發揮重要作用，但仍有許多問題有待深入研究，如在病毒感染后，介導CypA變化的關鍵病毒蛋白有哪些；細胞感染病毒后CypA的表達變化及機制還有待進一步探索；在天然免疫中，不同病毒感染后CypA既參與對I型干擾素的調控，又參與病毒復制過程，而CypA在兩者間的動態平衡過程中發揮何種作用尚不明確；以及CypA是否可通過干預病毒復制而成為一種新的抗病毒靶點藥物也有待深入研究。