蛋白質磷酸化對衣原體生理學影響的研究進展①

Emmanuel Wirekoh ARTHUR 王英姿 綜述 周 洲 審校

(南華大學病原微生物學研究所，衡陽 421001)

衣原體(Chlamydia)是一種在全球范圍內引起人和動物致病的專性胞內菌，其中肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae,Cpn)主要感染呼吸道引起肺炎、支氣管炎等炎癥病理反應，與肺癌、動脈粥樣硬化密切相關[1-3]；鸚鵡熱衣原體(Chlamydiapsittaci,Cps)通過鳥類的糞便傳播至人類呼吸系統，引起肺炎[4-5]；而沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,Ct)是世界范圍內引起廣泛性傳播感染的主要病原菌，其感染人體可引起沙眼、盆腔炎、不育癥和異位妊娠等炎性疾病[6-7]。衣原體具有獨特的雙相發育周期，即在具有感染性的原體(elementary body,EB)和復制型的網狀體(reticulate body,RB)之間相互轉化[8-10]。衣原體感染開始于EB黏附至宿主細胞，接觸后,其Ⅲ型分泌系統(type Ⅲ secretion system,T3SS)主要通過分泌效應蛋白誘導EB內化形成包涵體[11]。衣原體侵入宿主細胞后，通過轉運機制退出內吞途徑并遷移至核周。大多數衣原體蛋白被分泌至包涵體囊腔和宿主細胞胞質，導致宿主蛋白被募集、衣原體獲取營養物質、抗細胞凋亡通路的維持和調節固有免疫[12]。

磷酸化作為最常見的蛋白質翻譯后修飾的方式，是指由蛋白質激酶催化的將ATP磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上的過程，或在信號作用下結合GTP，在細胞信號轉導過程中起重要作用，也是調控蛋白質活力和功能最普遍的機制。蛋白質磷酸化可通過動態調控酶活性、蛋白定位、信號轉導和蛋白寡聚化在細菌感染引起致病的過程中發揮重要作用，如黏附至宿主細胞或調節信號轉導[13-14]。近年來，原核生物的蛋白磷酸化因能夠通過蛋白激酶和磷酸酶逆化修飾蛋白功能從而調節重要的生物學過程引起廣泛關注[15]。蛋白質磷酸化可調節衣原體生理學多樣性，對衣原體生長和發育具有重要影響。本文綜述了目前蛋白磷酸化對衣原體生理學的可能影響，旨在更深入地探討衣原體的致病機制。

1 蛋白質磷酸化的組成

蛋白質磷酸化包括蛋白質激酶和磷酸酶、雙組分信號系統(two-component signaling systems,TCSS)及合作-開關機制3個部分[16]。蛋白質激酶是催化蛋白質磷酸化過程的酶，這類酶可以改變蛋白質、酶的構象和活性，根據其底物蛋白被磷酸化的氨基酸殘基種類主要分為絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白質激酶、酪氨酸(Tyr)蛋白質激酶、色氨酸(Trp)蛋白質激酶和天冬氨酰基/谷氨酰基(Asn/GIn)蛋白質激酶五大類。磷酸酶與蛋白質激酶作用相反，是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶，能夠調控多種信號轉導通路的磷酸化過程[17]。TCSS由整合膜傳感器組氨酸激酶(histidine kinase,HK)和胞質應答調節因子(response regulator,RR)兩部分組成，分別由兩個不同的基因編碼，組成1個操縱子[18]。合作開關機制(partner switching mechanisms,PSM)是指細胞在信號轉導過程中起開關作用的蛋白,其能夠在單獨的模型中起作用[19-21]。

2 蛋白質磷酸化各組分對衣原體生理學的影響

2.1蛋白質激酶和磷酸酶對衣原體致病過程的影響 磷酸化蛋白在EB和RB之間分配不同，在EB和RB中分別含有74%和19%。EB磷酸化蛋白質主要包含參與中心和次級代謝的蛋白以及假定蛋白和毒力蛋白。雖然EB無代謝活性，但蛋白質組研究表明EB含有的參與中心和次級代謝的酶在進入宿主細胞后會發生代謝[22]。大多數EB磷酸化的代謝蛋白在RB中未被磷酸化，表明磷酸化作用可快速調節代謝酶活性。相反，RB磷酸化蛋白質組主要與蛋白質合成和折疊功能相關。

衣原體可通過T3SS和Ⅱ型分泌系統將蛋白注入包涵體囊腔和宿主細胞質[23]。目前已知4種衣原體蛋白可通過宿主激酶引起磷酸化：易位肌動蛋白募集磷酸化蛋白(TarP)、易位早期磷蛋白(TepP)、包涵體膜蛋白A(IncA)和包涵體膜蛋白G(IncG)。TarP 作為一種高分子量Tyr磷酸化蛋白存在于所有衣原體，并在衣原體入侵宿主細胞的過程中發揮重要作用。衣原體黏附于宿主細胞后，EB內的TarP通過T3SS分泌到宿主細胞質。CLIFTON等[24]證明Tarp在侵入位點被Tyr磷酸化并與肌動蛋白的募集相關，猜測其可能參與調節肌動蛋白募集反應的信號轉導，而這種募集反應將促進EB進入宿主細胞致病。TepP 是繼TarP后新發現的一種T3SS效應蛋白，在Ct中被稱為CT875，CHEN等[25]發現并證明其在衣原體進入宿主細胞早期易位，并被Tyr磷酸化。TepP作用于TarP的下游以募集骨架蛋白，有利于在衣原體進入宿主細胞期間啟動和擴增信號級聯反應導致感染。衣原體Inc是衣原體基因編碼、表達定位于包涵體膜上的蛋白質，其可介導衣原體與宿主細胞相互作用從而影響宿主細胞的生物學功能。ROCKY等[26]發現Cps的IncA是一種由宿主細胞酶磷酸化的Ser/Thr磷蛋白，在釋放至包涵體后被宿主激酶磷酸化，但IncA在衣原體感染過程中發揮何種作用有待進一步研究。SCIDMORE[27]等證明IncG的表達在內化后2 h內可以被檢測到，14-3-3β蛋白是第一個與Ct的IncG相互作用的磷酸Ser結合蛋白，但IncG在Ct發病機制中的作用尚不明確。

近年來，Ser/Thr/Tyr的蛋白質磷酸化由于可調節細菌生理學的多樣性而獲得了廣泛認識[14,28]。其中，Ser/Thr磷酸化通常由Hank′s型激酶介導，其與同源蛋白磷酸酶起作用并可能引起全面蛋白磷酸化，Tyr磷酸化通常由細菌酪氨酸激酶(bacterial tyrosine kinases,BY)介導。這些酶以ATP為磷酸供體，P-Ser/Thr/Tyr殘基形成更穩定的酯鍵，需要特定的蛋白磷酸酶與其同源激酶一起發揮作用[29]。蛋白磷酸酶分為兩個超家族：蛋白Ser/Thr磷酸酶(protein Ser/Thr phosphatases,PSPs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)，PSPs可進一步細分為磷蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatases，PPP)和金屬依賴性蛋白磷酸酶(metal-dependent protein phosphatases)[30]。WHITMORE等[31]證明BY激酶和PTP可利用宿主細胞蛋白作為底物導致細菌致病。Ct的CTL0511作為一種金屬依賴性蛋白磷酸酶，具有廣泛的底物特異性，證實了沙眼衣原體中存在可逆磷酸化網[32]。CLAYWELL等[32]和GLAYWELL等[33]在Ct的EB和RB中均檢測到磷酸酶活性，這對衣原體代謝和致病至關重要，并且能夠使色氨酸磷酸化(P-Ser)、蘇氨酸磷酸化(P-Thr)和酪氨酸磷酸化(P-Tyr)去磷酸化。此外，CppA是金屬依賴性蛋白磷酸酶的蛋白磷酸酶2C型(type 2C Ser/Thr protein phosph-atase,PP2C)亞家族成員，這項研究突出了CppA作為未來治療策略的新靶點并支持為衣原體和其他致病細菌設計更有效的PP2C磷酸酶抑制劑的可行性。CppA的底物易與Cpn的PknD磷酸化Tyr殘基結合,此結合特性支持衣原體中P-Tyr的存在[34]。因此，P-Tyr是否存在于其他衣原體中或是否僅限于Cpn仍有待進一步研究。

所有衣原體均編碼2種Hank′s型激酶，即分別存在于衣原體質膜的Pkn1、內膜的PknD及T3SS分泌的假定激酶Pkn5。JOHNSON等[35]證明Cpn的PknD在Thr/Tyr殘基上自磷酸化并磷酸化T3SS結構蛋白CdsD上的Ser/Tyr殘基，這是對Ser/Thr/Tyr殘基具有氨基酸特異性的細菌蛋白激酶的首次證明，同時也是第1個預測Ⅲ型分泌結構蛋白磷酸化的研究。PknD/Pkn1/CppA缺乏無義突變表明這些酶可能是衣原體生長所必需的[36]。抑制PknD顯著影響Cpn生長，進一步表明蛋白質磷酸化是衣原體生長發育的關鍵環節，且這些酶可能作為衣原體引起疾病的治療靶標發揮作用[37]。Ct的Pkn1和PknD在Ser/Thr殘基上自磷酸化并相互作用，表明Pkn1和PknD可交叉調節[38]。此外，包涵體膜蛋白IncG為Ct的Pkn1底物，CdsD作為Cpn的PknD底物，猜測Pkn1和PknD在宿主和衣原體相互作用中作為潛在介質從而影響衣原體發育和致病過程[35,38]。雖然Pkn1可在體外磷酸化IncG，但IncG可能在體內被宿主激酶磷酸化，類似于IncA。Pkn5因缺乏保守的催化殘基被認為是假定激酶，其在含T3SS基因的操縱子中被編碼，并在沙門氏菌替代T3SS測定中作為T3SS底物[39]。Cps在Pkn5的保守Ser殘基上有自由基突變，是宿主蛋白可能的磷酸化結合位點，從而在鼠肺炎模型中毒性減弱[40]。Cpn的Pkn5定位于包涵體膜，將進一步支持其作為效應蛋白的作用。

2.2TCSS對衣原體的轉錄調節 TCSS可通過適應性應答對不斷變化的環境進行調節，這些信號系統主要存在于衣原體和其他專性胞內寄生菌中。pH、溫度、滲透壓等條件的改變可導致HK在保守的組氨酸殘基上自磷酸化，隨后磷酸轉染至天冬氨酸殘基上同源RR的接收結構域。RR通過其輸出結構域寡聚化并與DNA結合調節轉錄[41]。衣原體含有1個完整的TCSS和1個獨立的RR，其可能調節衣原體對環境的適應性應答，從而影響發育過程[42]。TCSS與σ因子通過磷酸化共同參與衣原體發育過程的轉錄調節，并將參與的基因分別命名為CtcB與CtcC。CtcB與CtcC在衣原體發育晚期表達，可能與EB和RB的重組相關，并進一步影響衣原體黏附和入侵。而在衣原體EB中，磷酸化位點的CtcB是否影響轉錄功能尚不清楚[43]。CtcB與CtcC如何調節衣原體生理學過程有待進一步研究。

2.3合作開關機制對衣原體的轉錄調節 細菌除通過雙組分信號系統進行轉錄調節外，還可通過合作-開關機制(PSM)調節。衣原體可編碼σB型PSM的調控因子(RsB)，其PSM包括1個已確定的傳感器磷酸酶RsbU、1個假定的傳感器磷酸酶CT_589、2個雙抗σ因子、RsbV1和RsbV2及抗σ因子RsbW[20]。σ66作為衣原體調控管家基因轉錄的主要σ因子，主要受PSM調控。當RsbV1在Ct中過表達，σ66調控的基因的轉錄表現為上調且細胞生長數增加，而當RsbW過表達或當RsbV1失活時則恰好相反。RsbW和RsbU能夠控制RsbV1的磷酸化狀態，但RsbW磷酸化的RsbV2不能被RsbU去磷酸化[44]。因此，RsbV2的作用以及是否存在RsbW和RsbV2的其他靶標仍有待探究。

3 結語

與多數其他細菌相反，蛋白質激酶、磷酸酶和底物似乎不在衣原體的操縱子內編碼，導致磷蛋白網絡的定位變得復雜。盡管衣原體蛋白激酶、磷酸酶、TCSS和PSM的存在已經得到證實，但其在體內發揮的作用仍不明確。近年來，可用于衣原體的遺傳學方法迅速增加，用于研究磷酸化蛋白質組和轉錄組的方法可使研究者對衣原體生理學和發病機理有更深層次的理解。此外，由于蛋白質磷酸化對細菌生存和致病有重要影響，蛋白磷酸化如何促進細菌和宿主間的動態相互作用將成為未來研究的重點。