新型冠狀病毒核酸提取方法的性能評價及臨床應用

吳永彬，萬 穎，蔣紅玲，張 晶，辛 杰

廣西壯族自治區南溪山醫院檢驗科，廣西桂林 541002

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是一種具有包膜結構的正鏈單股RNA病毒，不僅可感染人類，還能感染其他哺乳類動物和鳥類，可引起呼吸道、腸道、肝臟和神經系統等病變[1]。目前，實時熒光反轉錄聚合酶鏈反應檢測SARS-CoV-2核酸是篩查和診斷新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的重要手段[2]，通過對SARS-CoV-2序列中的開放閱讀框(ORF)1ab 、核衣殼蛋白(N)及包膜蛋白(E)基因的特異性保守序列設計靶區域來實現標本核酸檢測。然而，該方法自臨床應用以來仍缺乏可靠的質量控制，已開展SARS-CoV-2核酸檢測的實驗室或機構大多采用自建體系進行檢測，沒有形成統一的技術標準。就試劑而言，各廠家推薦的標本前處理方法及核酸提取方法并不統一，試劑之間的差異可能會導致檢測結果的不一致。當某項定量檢測項目在正式用于標本檢測前或檢測系統有重大改變后，必須對檢測系統的分析性能做出詳細、充分的評價，確認檢測系統符合臨床要求[3]。本研究評價了3種不同的SARS-CoV-2核酸提取方法用于核酸定量檢測時的分析性能及臨床應用價值，以期為COVID-19的實驗室檢測和臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取SARS-CoV-2核酸檢測陽性的COVID-19確診病例17例，其中男8例，女9例；年齡24～79歲，中位年齡42歲；病程4～24 d；危重型4例，普通型13例。所有患者SARS-CoV-2核酸檢測標本于2020年2月12—19日在本院感染性疾病病區收集，其中深咳痰液標本13份，大便標本4份。COVID-19診斷標準參考《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第五版)》[4]。本研究經本院倫理審查委員會審核通過(批準文號2020NXSYYEC-003)。

1.2儀器與試劑 電熱恒溫水浴箱(型號：HH.W21.600S，上海躍進醫療器械有限公司)，漩渦混合器(型號：XH-B，江蘇康健醫療用品有限公司)，全自動核酸提取系統(型號：Natch CS,湖南圣湘生物科技有限公司)，熒光定量PCR擴增系統(型號：SLAN-96P，上海宏石醫療科技有限公司)。樣本釋放劑(批號：S1014，湖南圣湘生物科技有限公司，裂解法)，核酸提取及純化試劑(批號：SDK60102，江蘇碩世科技股份有限公司，柱提法)，核酸提取或純化試劑(批號：S1002，湖南圣湘生物科技有限公司，磁珠法)，核酸擴增試劑(批號：2020088，湖南圣湘生物科技有限公司，熒光PCR法)。

1.3方法

1.3.1SARS-CoV-2核酸檢測 所有標本在檢測前先進行56 ℃、30 min滅活，并混勻5～10 s后待檢。使用3種SARS-CoV-2核酸提取方法(裂解法、柱提法、磁珠法)，按操作說明書提取核酸，最后均提取20 μL SARS-CoV-2核酸液作為擴增模板。在熒光定量PCR擴增系統上選擇FAM(ORF1ab)和ROX(N) 通道檢測SARS-CoV-2核酸，選擇HEX通道檢測內標。設置50 ℃、熱循環30 min進行反轉錄；在95 ℃下反應1 min使cDNA預變性；然后按照95 ℃、15 s，60 ℃、30 s循環45次。最后根據擴增信號得出Ct值，并根據核酸擴增試劑說明書判定檢測結果。

1.3.2性能驗證

1.3.2.3最低檢測限驗證 選取低水平且雙靶標(ORF1ab、N)Ct值接近的弱陽性標本8份，用陰性對照標本依次按1∶1的比例稀釋為8個水平接近試劑盒定量檢測下限的標本，分別用3種方法提取SARS-CoV-2核酸并檢測，每份標本重復檢測4次，連續檢測10 d。參考EP7-A2[7]，計算陽性檢出率及最低檢測限。

1.3.2.4臨床應用評估 取17份COVID-19確診病例標本，分別采用3種方法同時提取并檢測SARS-CoV-2核酸，每個標本重復檢測3次，計算3種核酸提取方法下檢測結果的陽性符合率、靶標檢出率，分析3種核酸提取方法兩兩之間檢測結果的相關性。

2 結 果

2.1精密度驗證結果 3種核酸提取方法下高、中、低水平標本檢測結果的CVr和CVi均小于目標CV(5%)，符合廠家聲明的精密度標準，可滿足臨床需求。見表1。

表1 精密度驗證結果

2.2正確度驗證結果 3種核酸提取方法下檢測3個水平標本的偏倚均小于允許偏倚，可接受，其中采用裂解法提取核酸時的偏倚較柱提法和磁珠法大，采用磁珠法提取核酸時3個水平標本的檢測偏倚均最小。見表2。

表2 正確度驗證結果

2.3最低檢測限驗證結果 3種核酸提取方法下8個水平標本的檢出率見表3。Probit回歸分析結果顯示，模型擬合度均可接受，采用裂解法、柱提法、磁珠法提取核酸時的最低檢測限(Ct值)分別是37.42、37.87、39.61，均符合廠家聲明的最低檢測限。

表3 3種核酸提取方法下的檢出率比較[n(%)]

2.4方法學比較 在17份COVID-19確診病例標本中，有15份標本在3種核酸提取方法下均檢測為陽性，其中裂解法和柱提法、磁珠法和柱提法的陽性符合率均為94.11%，裂解法和磁珠法的陽性符合率為88.23%。3種核酸提取方法下的檢測結果兩兩之間均呈良好的線性關系(P<0.05)，其中，采用柱提法和磁珠法提取核酸時的檢測結果相關性最好(r=0.905，P<0.001)。見圖1。

注：A為柱提法與裂解法檢測結果的相關性分析；B為磁珠法與裂解法檢測結果的相關性分析；C為柱提法與磁珠法檢測結果的相關性分析。

2.53種核酸提取方法下的靶標檢出率比較 17例COVID-19確診病例標本中，采用裂解法提取核酸時檢出15例陽性，陽性率為88.2%，柱提法提取核酸時檢出16例陽性，陽性率為94.1%，磁珠法提取核酸時檢出17例陽性，陽性率為100.0%。進一步分析靶標檢出率，雙靶標(ORF1ab+/N+)檢出率最高的是磁珠法，為64.7%(11/17)，其次是柱提法的52.9%(9/17)和裂解法的41.2%(7/17)；單靶標中，ORF1ab-/N+在3種核酸提取方法中的檢出率相當，而ORF1ab+/N-的檢出率均較低。3種核酸提取方法下的靶標(ORF1ab+/N-、ORF1ab-/N+、ORF1ab+/N+)檢出率比較，差異無統計學差異(P>0.05)。見圖2。

注：a為ORF1ab+/N-；b為ORF1ab-/N+；c為ORF1ab+/N+；d為ORF1ab-/N-。

3 討 論

目前，國內大多數實驗室常使用自建檢測系統檢測SARS-CoV-2[8]，對于實驗室自建檢測系統，我國《臨床實驗室管理辦法》和《醫學實驗室質量和能力認可準則》均要求需對檢驗程序的性能進行驗證，證實其能滿足預期用途后方可用于臨床檢測。但國內目前對SARS-CoV-2自建檢測系統性能驗證的具體方法尚未達成廣泛共識，本研究對3種核酸提取方法下自建檢測系統的精密度、正確度、最低檢測限等指標進行了性能分析，并將其用于臨床評價。

為使檢測結果具有可比性，本研究采取了除核酸提取過程不同外，其余操作均相同的檢測方案，整體來看，3種核酸提取方法下自建檢測系統檢測SARS-CoV-2的精密度、正確度均通過驗證，但采用磁珠法提取核酸時的檢測偏倚、CVr和CVi普遍比裂解法與柱提法小(除磁珠法低水平標本的CVi和中水平標本的CVr略大于柱提法外)，表明與人工操作相比，自動化操作可減少操作誤差，提高檢測結果的準確度。此外，采用磁珠法提取核酸時的最低檢測限(Ct值)稍優于裂解法與柱提法，檢測靈敏度更高，這有利于低水平病毒RNA的檢出。考慮出現上述差異與試劑提取原理有關，裂解法是一種通過簡化的蛋白變性劑和生化試劑混合來抽提核酸的方法，操作簡單，標本量僅需10 μL，適合病毒載量高、雜質少的標本，但如果標本不滿足上述要求則易漏檢，產生“假陰性”結果。柱提法是采用特殊玻璃纖維濾膜高效吸附核酸片段來提取核酸，操作環節較多，易造成核酸丟失，但其最終獲得的核酸純度較高。磁珠法是以磁珠為載體進行分離和轉移來實現核酸提取的方法，在保證核酸提取純度的同時，也保證了模板純度。

本研究以17例COVID-19確診病例標本為臨床研究對象，比較了3種核酸提取方法下檢測結果的陽性符合率及結果間的相關性，結果顯示，3種核酸提取方法下檢測結果的陽性符合率較高，且結果間兩兩均呈線性相關。本研究還比較了3種核酸提取方法下靶標的檢出情況，結果顯示，3種核酸提取方法下的靶標(ORF1ab+/N-、ORF1ab-/N+、ORF1ab+/N+)檢出率比較，差異無統計學差異(P>0.05)，說明這3種核酸提取方法均可用于SARS-CoV-2核酸檢測。但值得注意的是，本研究納入的臨床樣本量較少，患者的標本類型、發病時間、病情嚴重程度、用藥情況等因素也不一致，因此結果有待后續的大樣本研究進一步驗證。

綜上所述，本研究評價的這3種核酸提取方法均可滿足臨床SARS-CoV-2的檢測需求，且磁珠法相較裂解法與柱提法具有更好的性能。