CXCL8在宮頸癌組織中的表達水平及臨床意義

鄭鑫飛，阮俊豪，陳翔藝，張淑芳，葉愛華，王詩穎，劉榮強

福建醫科大學附屬南平市第一醫院放療科，福建南平 353000

宮頸癌是女性生殖系統腫瘤中發病率最高的惡性腫瘤，據統計，2018年全球宮頸癌患病人數為57萬，病死人數為31.1萬，其中約84%的宮頸癌患者來自發展中國家[1]。隨著人們生活水平的提高和惡性腫瘤防治理念的逐漸普及，宮頸癌的預防與控制工作初見成效，但仍有較高的發病率[2]。因此，開發比婦科內鏡檢查、高危型人乳頭瘤病毒及宮頸癌液基細胞檢測更加有效的早期篩查方法顯得尤為重要。目前，宮頸癌治療手段主要包括手術、化療及放療，早期宮頸癌患者經過系統治療后生存率明顯提高，但是對于復發或新發轉移性病灶患者治療手段仍然十分有限。腫瘤基因學是腫瘤研究的基礎，對腫瘤的生物學特征及發病機制進行探討，將有助于在未來開發出更有效的診斷及治療方法[3]。CXC趨化因子配體8(CXCL8)是由中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、T細胞、上皮細胞和內皮細胞產生的趨化因子[4]。有研究發現，在腫瘤微環境中CXCL8通過自分泌或旁分泌的方式促進腫瘤細胞生長和發揮免疫抑制作用[5]。CXCL8作為一種重要的多功能趨化細胞因子，與多種腫瘤的發生、轉移、耐藥及預后相關，故本研究擬探討CXCL8水平與宮頸癌患者臨床特征和預后的關系，旨在為臨床宮頸癌診療提供參考依據。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1數據庫研究對象 選取TCGA和GTEx數據庫來源的306份宮頸癌組織和13份正常宮頸組織標本，以及有總生存期(OS)資料的宮頸癌患者292例為在線數據分析研究對象。

1.1.2臨床研究對象 選取2012年7月至2019年2月本院收治的76例宮頸癌患者，所有患者的宮頸癌組織及癌旁組織標本均經病理活檢或手術采集。納入標準：符合宮頸癌診斷標準[6]，并經組織病理學檢查證實；癌旁組織為距腫瘤病灶5 cm以上的組織，經免疫組織化學染色證實；所有患者均為初診，且參與本研究前未行放療或化療。排除標準：年齡>80歲；合并其他較為嚴重的婦科疾病；合并其他類型惡性腫瘤；合并嚴重心、肝、腎等重要臟器功能障礙；合并認知障礙及精神疾病；無完整的臨床及隨訪資料。76例宮頸癌患者年齡21～80歲，平均(49.69±13.54)歲；宮頸癌TNM分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期17例，Ⅲ期 7 例,Ⅳ期13例；分化程度：低分化52例，中、高分化24例；有遠處轉移的25例，無遠處轉移的51例；有淋巴結轉移的29 例，無淋巴結轉移的47例；有淋巴脈管浸潤的47例，無淋巴脈管浸潤的29例；浸潤深度：T1+T2有62例，T3+T4有14例。所有患者的治療均參照《2019 NCCN宮頸癌臨床實踐指南(第1版)》，即Ⅰ～ⅡA期采用手術或放療，手術方式為根治性子宮切除術、盆腔淋巴結切除術和(或)腹主動脈淋巴結取樣術，且當術后有復發高危因素(子宮旁、深間質浸潤或淋巴結轉移)時需輔助同步放、化療；ⅡB～ⅣA期采用同步放化療；ⅣB期以系統支持治療為主。本研究獲得本院醫學倫理委員會審核批準，所有患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1在線數據分析 采用基因表達譜數據動態分析(GEPIA)網站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TCGA和GTEx數據庫來源的306份宮頸癌組織和13份正常宮頸組織標本中的CXCL8表達水平。進入Survival頁面繪制生存曲線圖，預后指標為OS，將TCGA和GTEx數據庫來源的有OS資料的宮頸癌患者292例以CXCL8中位水平為界分為CXCL8低表達和CXCL8高表達患者，比較CXCL8高、低表達患者的預后情況。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測組織CXCL8表達水平 本院宮頸癌患者術后均留取新鮮組織標本于-80 ℃凍存。檢測時將冰凍標本取出，解凍后打成勻漿，按照Trizol試劑盒說明書(美國Invitrogen公司)加入1 mL Trizol試劑，振蕩15 s，靜置2 min，4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min。采用紫外分光光度計檢測總RNA純度。總RNA利用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR反應，CXCL8引物根據NCBI數據庫收錄的序列，采用Oligo Architect在線引物設計軟件進行設計，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CXCL8上游引物序列：5′-CTTTGTCCATTCCCACTTCTGA-3′，下游引物序列：5′-TCCCTAACGGTTGCCTTTGTAT-3′。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，95 ℃變性15 s，共計40個循環，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參。通過 2-ΔΔCt法計算CXCL8的表達水平。

1.3隨訪 采用電話和門診復查的方式進行隨訪，隨訪截止2020年2月或患者死亡。OS的定義為從腫瘤確診至隨訪截止或死亡的時間。

2 結 果

2.1在線分析宮頸癌組織CXCL8表達水平及其與預后的關系 采用GEPIA網站分析TCGA和GTEx數據庫來源的宮頸癌組織中CXCL8的表達水平，結果顯示，宮頸癌組織中CXCL8表達水平明顯高于正常宮頸組織，差異有統計學意義(P<0.05) ，見圖1。采用GEPIA網站分析TCGA和GTEx數據庫來源的宮頸癌患者的預后，生存曲線分析結果顯示，CXCL8低表達患者總生存率明顯高于CXCL8高表達患者，差異有統計學意義(P<0.05) ，見圖2。

注：*P<0.001。

圖2 數據庫來源的宮頸癌CXCL8高、低表達患者的生存曲線

2.2宮頸癌組織與癌旁組織CXCL8表達水平比較 本院76例患者宮頸癌組織的CXCL8表達水平(1.575±0.421)高于癌旁組織(0.705±0.272)，差異有統計學意義(P<0.05) 。

2.3CXCL8表達水平與宮頸癌臨床病理特征的關系 將本院76例患者的宮頸癌組織以CXCL8水平的均值(1.575)為界分為CXCL8低表達30例和CXCL8高表達46例，分析CXCL8表達水平與宮頸癌臨床病理特征的關系，結果顯示，CXCL8表達水平與患者年齡、宮頸癌TNM分期、分化程度有關(P<0.05)，與宮頸癌淋巴脈管浸潤、浸潤深度、淋巴結轉移和遠處轉移無關(P>0.05) ，見表1。

表1 CXCL8表達水平與宮頸癌臨床病理特征的關系(n)

2.4CXCL8表達水平與宮頸癌預后的關系 對本院76例宮頸癌患者隨訪12～84個月，中位OS為25.80個月，其中CXCL8高表達患者的中位OS為23.65個月，低于CXCL8低表達患者的30.48個月，差異有統計學意義(P<0.05),生存曲線見圖3。單因素Cox回歸分析結果顯示，CXCL8表達水平、TNM分期與浸潤深度是宮頸癌患者預后的影響因素(P<0.05)；多因素Cox回歸分析結果顯示，CXCL8表達水平是宮頸癌患者預后的獨立影響因素(P<0.05)，見表2。

圖3 宮頸癌CXCL8高、低表達患者的生存曲線

表2 宮頸癌患者預后的影響因素分析

3 討 論

宮頸癌是女性腫瘤相關死亡的常見原因之一。在我國，宮頸癌每年新發病例數約13.15 萬,占全球宮頸癌新發病例數的28.8%[3]。高危型人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌的主要病因，而免疫抑制狀態，如感染人類免疫缺陷病毒或服用免疫抑制劑等可增加對其的易感性。晚期、轉移、復發的宮頸癌患者治療效果較差，近年來免疫治療，特別是程序性死亡受體-1、程序性死亡配體-1抑制劑等免疫治療藥物的開發和應用為晚期、復發、轉移的宮頸癌患者帶來了新的希望，但免疫治療并不是對所有宮頸癌患者都有效[7]。因此，找到更多參與宮頸癌發病機制的基因或蛋白，對開發新藥物、宮頸癌患者風險分層，以及實施個體化治療都至關重要。

CXCL8是一種屬于彈性蛋白樣重組體的CXC趨化因子。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)等促炎細胞因子可快速誘導CXCL8的表達。有研究證實，CXCL8在食管癌、直腸癌、非霍奇金淋巴瘤組織中的表達水平較正常組織明顯升高[8-10]，且在乳腺癌、肺癌、直腸癌、胃癌、膠質瘤、胰腺癌患者中高表達的CXCL8與預后呈負相關[11-16]。本研究中，TCGA和GTEx數據庫來源的宮頸癌組織中CXCL8表達水平明顯高于正常宮頸組織；本院76例患者宮頸癌組織的CXCL8表達水平明顯高于癌旁組織，提示CXCL8表達水平升高與宮頸癌的發生有關。研究發現，阻斷CXCL8在細胞內的信號傳導可導致細胞增殖能力降低及細胞凋亡[17-19]，提示CXCL8參與了腫瘤的發生、進展。此外，CXCL8作為一種重要的多功能細胞因子，通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸激酶(AKT)、兩面神激酶(JAK)/非受體型酪氨酸蛋白激酶(STAT)等信號通路發揮致癌作用[14,20]。PI3K/AKT信號通路的激活導致基質金屬蛋白酶(MMP)2和MMP9的表達上調，從而協助腫瘤細胞在侵襲和轉移過程中穿透機體天然組織屏障、基底膜和細胞外基質，增強腫瘤細胞的增殖與侵襲能力，導致腫瘤的遠處轉移與局部浸潤[21]。此外，CXCL8通過改變與凋亡和多藥耐藥相關的信號通路，直接影響腫瘤細胞對化療的敏感性，從而影響患者預后[22]。有學者發現，使用CXCL8受體拮抗劑可以抑制腫瘤微環境中的血管生成，抑制腫瘤細胞生長、增殖、遷移和侵襲[23]。鑒于以上證據，開發CXCL8及其受體拮抗劑類藥物可能會為宮頸癌精準治療帶來新的希望。

本研究通過分析數據庫相關資料發現CXCL8表達水平在宮頸癌組織中明顯升高，且與預后有關。隨后使用本院76例宮頸癌組織及癌旁組織進行了驗證，進一步證實在宮頸癌組織中CXCL8表達水平明顯高于癌旁組織，CXCL8表達水平與年齡、TNM分期、分化程度有關，且CXCL8表達水平是宮頸癌患者預后的獨立影響因素，上述結果均提示CXCL8在宮頸癌的發生、發展過程中發揮了重要作用，可作為判斷宮頸癌患者預后的指標，為臨床個體化治療提供依據。