有機污染物芘脅迫下白菜生理特性變化規律

杜志偉,楊肖松, 劉月仙,*,解小凡,張瑞麗,張 萌,王 偉

1 中國科學院大學資源與環境學院, 北京 100049 2 中國礦業大學化學(北京)與環境工程學院, 北京 100083 3 煤炭開采水資源保護與利用國家重點實驗室，北京 102211 4 農業農村部環境保護科研監測所，天津 300191

多環芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是一類具有兩個或兩個以上苯環的芳香烴,其中有16 種被美國環保署確定為優先控制的有機污染物質[1],是典型的持久性有機污染物,具有潛在致癌性、致突變性和毒性的特點[2],近幾十年來備受關注。PAHs主要由不完全燃燒的過程形成,如化石燃料燃燒、生物質燃燒和石油泄漏等[3]。多環芳烴釋放到環境中后,可通過干濕大氣沉降和直接空氣-土壤交換的方式沉積到土壤中[4],土壤作為重要的環境介質,承擔著90%以上的PAHs環境負荷[5]。近些年來,土壤污染問題日益嚴重,對人體健康以及生態環境都造成了一定的威脅,根據全國2005- 2013年全國土壤污染普查結果顯示,我國部分地區土壤污染嚴重,全國現有近1/5耕地受到不同程度的污染,多環芳烴類有機物污染點位超標率為1.4%[6]。與低分子量PAHs(≤ 3個苯環)相比,高分子量PAHs(≥4個苯環)更難被降解而在土壤環境中長期存在[7]。而芘是有4個苯環結構的多環芳烴,與PAHs有良好的相關性,是高分子量多環芳烴的典型代表,常作為監測的指示化合物[7- 8]。Peng等[9]測得北京土壤中的芘濃度范圍在6.9—1560.8 μg/kg,平均值為127.3 μg/kg；朱媛媛等[10]對天津市土壤的多環芳烴進行分析,芘含量在12.5—183 μg/kg之間；李靜雅等[11]在長江三角洲區域11個行政市測定表層土壤中16種優控PAHs濃度范圍10.1—3058.6 μg/kg。

目前,已有不少針對多環芳烴對不同植物生長影響的研究,不同植物對有機污染物的毒性響應具有明顯差異[12]。較高濃度的PAHs對植物生長具有抑制作用,高濃度多環芳烴脅迫下的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、辣椒(CapsicumannuumL.)、小麥(Triticumacstivnm)、白菜(Brassicapekimensis)、西紅柿(Solanumlycopersicum)、玉米(ZeamaysL.)和紅豆(Vignaangularis)都出現了生長受抑制的現象[13]；蔡順香[14]研究發現:50—200 mg/kg施芘水平下菠菜幼苗葉片的各項葉綠體色素含量與對照無顯著差異,施芘濃度大于50 mg/kg時株高、根和莖葉的鮮重顯著降低,且丙二醛積累量提高；而Maliszewska-Kordybach等[15]研究發現,玉米、燕麥等作物在低于10 mg/L的PAHs質量濃度的土壤中時,具有刺激其生長發育的作用。白菜是我國主要種植的蔬菜,也是大量食用的蔬菜,目前針對不同品種的白菜在多環芳烴脅迫下的生理特征研究較少,以華北地區常見的11種白菜為研究對象,探究有機污染物芘對白菜的生理指標影響具有重要意義,旨在為PAHs對植物的毒害機理研究和蔬菜的安全生產提供一定的理論依據。

1 研究材料和方法

1.1 實驗材料

選取我國華北地區常見的11個不同品種的白菜作為實驗對象：京翠60(JC- 60),京秋65(JQ- 65),京春娃2號(JCW- 2),京春白(JCB),京翠70(JC- 70),京春綠(JCL),北京桔紅二號(JH- 2),中白50(ZB- 50),吉紅308(JH- 308),菊心(JX)和快菜1號(KC- 1),均購自北京市農林科學院京研益農種業科技有限公司和中國農業科學院蔬菜花卉研究所。芘(>95%,GC)購自上海阿拉丁生化股份有限公司。

實驗土壤取自北京市懷柔區中國科學院大學后山,自然風干后挑出碎石枝葉過3 mm篩,儲存備用。實驗土壤有機質含量為5%,pH為8.42；土壤中芘的濃度為0.09 mg/kg,根據相關文獻[16],土壤中的芘含量<0.4 mg/kg時,可以忽略不記。

1.2 實驗設計

根據楊肖松等[7]進行的芘對白菜生長預實驗,設置5、15、45、135、405 mg/kg以及對照組共六個芘濃度處理水平。土壤毒性配置方法參照孫鐵珩[17]推薦的方法,具體為：稱取35 g芘于適量的丙酮中溶解,加入到10 kg的土壤中,即芘濃度為3500 mg/kg的土壤,置于通風櫥中過夜,待丙酮完全揮發后攪拌均勻。在上述土壤中分別加入不同質量且未被芘污染的土壤,進行稀釋攪拌,配置成不同處理濃度的土壤。分別稱取六種芘處理濃度的土壤各7 kg于高18 cm、上口徑為23 cm、下口徑為21 cm的花盆中。為了確保白菜有足夠的養分進行正常的生長,每個花盆中加入氮(CO(NH2)2)、磷(KH2PO4)、鉀(KCl)肥各2.24、3.07、0.32 g,同時澆水至田間持水量平衡一周。白菜種子需預先進行消毒處理,在75%酒精中浸泡5 min后,用蒸餾水洗凈,再置于55°C的水中攪拌浸泡。

將11種白菜種子在每個花盆中播種15粒,置于溫室中培養,平均低溫24℃,平均高溫32℃。待長出四片真葉后,每盆中留一株白菜幼苗,每個品種進行3次重復。白菜從播種到成熟收獲共歷時80 d。

1.3 實驗方法

(1)生物量(鮮重)的測定

白菜整株收獲后用自來水沖洗掉表面的土及灰塵,再用去離子水沖洗三遍,濾紙擦干表面水分后,用天秤稱取植株的重量。

(2)丙二醛(MDA)的測定

丙二醛的含量采用植物MDA檢測試劑盒(TBA比色法)測定,購自北京雷根生物科技有限公司。具體步驟為稱取0.4 g樣品剪碎后,加入4 mL組織勻漿液充分研磨,經4000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,先后分別加入0.005 mL抗氧化劑、TBA工作液,測定其在450、532、600 nm處的吸光度值。

(2)葉綠素的測定

葉綠素a和葉綠素b的含量測定根據Gitelson等[18]采用的方法,稱取待測白菜葉片0.1 g置于研缽中,加入少量95%乙醇和少量的CaCO3,研磨成白色勻漿,過濾至25 mL比色管中,用95%的乙醇定容后,于波長665、649、470 nm處測定吸光度值。

1.4 數據處理及分析

采用Excel 2016、SPSS 24.0 進行數據處理和多因素方差分析,采用最小顯著性差異法(LSD,P<0.05)進行多重比較；利用Origin 2018進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 生物量(鮮重)

白菜的生物量在不同濃度芘作用下以及不同種類之間的雙因素方差分析表明,白菜的種類和芘濃度均對生物量有顯著影響(P<0.001),且白菜種類和芘濃度存在交互作用。表1顯示的是11種白菜生物量在不同濃度芘作用下的變化情況,總體呈現兩種規律：一是倒“U”型,二是隨著芘濃度的增加,白菜生物量降低。其中,京春娃2號、京春白、京翠70、京春綠、北京桔紅二號、中白50、吉紅308、菊心、快菜1號這9種白菜品種的生物量隨著芘濃度的增加呈現出先升高后降低的趨勢,即倒“U”型。與對照組相比,9種白菜在中低濃度芘脅迫下,快菜一號的生物量變化最大,在添加芘濃度為45 mg/kg時,生物量顯著升高了178.62%,而品種京翠70是這9種白菜品種變化最小的,在添加芘濃度為15 mg/kg時生物量僅升高16.12%,其他7種白菜生物量上升的變化范圍為17.57%—158.40%。京翠60、京秋65這兩種白菜品種的生物量隨著芘濃度升高而逐漸降低；其中,在405 mg/kg芘濃度的脅迫下生物量顯著降低,京翠60的生物量降低率(59.25%)高于京秋65生物量降低率(47.96%)。

2.2 丙二醛(MDA)

根據雙因素方差分析,不同白菜品種的丙二醛(MDA)含量存在顯著性差異(P<0.001)。丙二醛是反映植物脂質過氧化程度的指標,是生物膜系統脂質過氧化的產物,能夠間接的反映植物在受到外界的脅迫時,細胞的受損程度,MDA含量越大,膜受損程度越大[19]。如圖1所示,華北地區11種白菜在不同濃度土壤芘脅迫下的MDA含量呈現出不同的變化規律：一是不同濃度芘脅迫下,白菜MDA含量無顯著性變化,以京春娃、京春白和中白50這3種白菜品種為代表,與對照組相比,京春娃的MDA下降率最高(26.35%),京春白上升率最高(19.9%)；二是白菜MDA含量隨芘濃度的增加而呈上升趨勢,如京翠60、京秋65、吉紅308和快菜一號這四種白菜品種,與對照相比,MDA含量升高率為0.18%—98.13%,且在高濃度405 mg/kg芘處理時,MDA含量顯著性升高。三是白菜MDA含量在不同芘脅迫下均低于對照組,如京翠70、京春綠和北京桔紅二號這3個白菜品種的MDA在低濃度芘脅迫時(5 mg/kg)顯著降低,降低率分別為25.72%、60.38%、26.8%；高濃度芘脅迫(135、405 mg/kg)下與對照組相比,京翠70的 MDA含量顯著降低(41.51%),京春綠和北京桔紅二號略有下降但不顯著。

表1 芘脅迫對白菜生物量的影響

表中數據為3次重復的平均值±標準誤；不同小寫字母代表在0.05水平上差異顯著

圖1 芘脅迫對白菜丙二醛(MDA)的影響Fig.1 Effect of pyrene stress on Malondialdehyde content of Chinese cabbage圖中同一品種白菜小寫字母相同表示濃度間無顯著性差異;京翠60(JC-60);京秋65(JQ-65);京春娃2號(JCW-2);京春白(JCB);京翠70(JC-70);京春綠(JCL);桔紅2號(JH-2);中白50(ZB-50);吉紅308(JH-308);菊心(JX);快菜1號(KC-1)

2.3 葉綠素

對葉綠素a和葉綠素b進行雙因素方差分析,結果顯示白菜的品種和芘的濃度都會顯著影響白菜葉綠素a和葉綠素b的含量(P<0.001)。葉綠素是高等植物進行光合作用的重要色素,直接影響到植物的光合作用,葉綠素含量的變化可以作為衡量葉片衰老的重要生理指標[20],也能在一定程度上反映植物的代謝情況和抗逆性[21]。如圖2和圖3所示,同種白菜的葉綠素a和葉綠素b含量隨著土壤芘濃度的增加呈現出相同的變化趨勢。而11種白菜的葉綠素含量在芘脅迫下存在不同的變化規律：一是葉綠素含量在低濃度芘脅迫下(5 mg/kg)有上升趨勢,如京翠60、京秋65和菊心三種白菜,其中京翠60的葉綠素a和葉綠素b含量顯著升高,分別升高106.9%和102.8%；在中低濃度芘處理(15、45 mg/kg)下,葉綠素含量略有下降趨勢,相比對照組,葉綠素a和葉綠素b分別降低了9.86%—12.34%和8.25%—20.21%；在高濃度(135、405 mg/kg)脅迫下與對照組相比,京翠60的葉綠素a含量顯著升高136.32%,京秋65的葉綠素b含量顯著增加157.53%。二是中低濃度芘脅迫下下降,高濃度上升的變化規律,如京春娃、北京桔紅、中白50和快菜一號四種白菜在5 mg/kg芘濃度下葉綠素a含量降低了7.83%—23.71%,葉綠素b含量降低了16.9%—39.74%；在中高濃度(45、135、405 mg/kg)的芘脅迫下呈現上升的趨勢,葉綠素a和b的增加率分別為1.53%—21.34%和2.51%—18.86%。三是葉綠素含量隨著脅迫濃度的增加而逐漸升高,如京春白、京翠70、京春綠和吉紅308四種白菜,在405 mg/kg濃度芘脅迫下,4種白菜的葉綠素a和葉綠素b分別升高了84.1%—122.53%和77.37%—120.29%。

圖2 芘脅迫對白菜葉綠素a的影響Fig.2 Effect of pyrene stress on chlorophyll a content of Chinese cabbage圖中同一品種白菜小寫字母相同表示濃度間無顯著性差異

圖3 芘脅迫對白菜葉綠素b的影響Fig.3 Effect of pyrene stress on chlorophyll b content of Chinese cabbage圖中同一品種白菜小寫字母相同表示濃度間無顯著性差異

3 討論

3.1 芘脅迫對生物量的影響

植物的生物量變化是植物在受到脅迫時最直觀的表現指標,通常植物對多環芳烴的脅迫有一定的耐受閾值,閾值內植物生物量變化不明顯,閾值以外則生長受到抑制[22]。在本研究中,生物量在芘脅迫下表現兩種變化規律,京翠60和京秋65這兩種白菜品種隨著芘濃度的增加,生物量有逐漸下降趨勢,可能是PAHs阻礙植物根系從被污染土壤中吸收養分和水,進而影響植物的生長和生理特性[23]。而另外9種白菜生物量呈現“倒U型”變化趨勢,在芘脅迫下生物量表現為低濃度升高,高濃度降低,這與尹東雪等[24]采用芘對擬南芥毒性效應的研究以及陸志強[25]、洪有為等[26]對秋茄在芘脅迫下的生長情況研究結果是一致的。高濃度的多環芳烴對植物的生長具有抑制的作用,使植物的根毛減少、葉片發黃、株高下降、生物量顯著降低[13]。而在低濃度的多環芳烴脅迫時,對植物起到了刺激作用,目前大多認為低濃度的刺激作用可能是因為PAHs的環狀結構與植物體內的生長素等內源激素具有相似性,使其具有與生長素相似的作用[27],促進植物生長。

3.2 芘脅迫對MDA的影響

多環芳烴會對植物產生氧化脅迫,破壞細胞膜結構,造成細胞內電解質外滲率增大,丙二醛(MDA)含量可以一定程度上反應細胞受傷害和對逆境的反應程度[28]。白菜在不同芘的濃度條件下,丙二醛含量存在不同的變化規律。在本研究中部分白菜品種在中低濃度的芘處理下MDA含量無顯著變化,在高濃度芘脅迫下,白菜MDA含量均顯著升高,這與蔡順香等[29]人和朱燦等[30]人的研究結果一致,說明這些白菜品種在中低濃度芘脅迫下細胞受到的損害較小,而高濃度的芘會對植物造成一定程度的損傷。同時研究發現部分白菜品種在受到芘脅迫時,MDA含量均顯著降低,在脅迫濃度范圍內均未高于對照組,推測多環芳烴在一定的濃度下會對植物的正常應激性機制造成傷害[21,23],長時間暴露在多環芳烴脅迫下抗氧化酶的酶活力會被誘導[32- 33],導致脂質過氧化作用產生的MDA含量降低。也存在植物在多環芳烴脅迫下代謝失衡產生活性氧,作為信號分子傳導到植物體內后觸發抗氧化系統的防御機制,進而適應環境[34- 35]。

3.3 芘脅迫對葉綠素含量的影響

一般認為土壤有機物污染會破壞植物體內的葉綠素合成酶,或者激活葉綠素降解酶,導致葉綠素含量下降[20],但也存在抗逆性較強的植物,在有機物脅迫下葉綠素含量上升[36]。我們研究發現多環芳烴芘的添加量會對白菜葉綠素含量產生一定的影響,如京翠60、京秋65等這些白菜品種中的葉綠素含量在低濃度芘處理下有上升的趨勢,在中濃度的脅迫下略有下降的趨勢,變化不顯著,在高濃度脅迫下與對照組相比葉綠素含量顯著升高。唐璇[37]研究發現,中濃度的多環芳烴脅迫蘿卜幼苗,葉綠素b的合成受到抑制,高濃度脅迫下促進葉綠素a的合成,同時尹東雪等[24]用芘對擬南芥生物毒性的研究中,葉片的葉綠素呈現出先上升后下降的趨勢,與本實驗在中低濃度下的反應相似,可能是在低濃度的污染下,相關的酶活性未受到抑制,植物可以充分自我調節。同時,京春白等4種白菜隨著芘濃度的增加,葉綠素含量呈現逐漸增高的趨勢,在高濃度芘脅迫下與對照組相比顯著升高。與蔡順香等[38]用芘對小白菜(日本華京冠菜)幼苗脅迫的實驗結果相反,而孫成芬等[39]在土壤萘對玉米苗期的生理影響的研究中發現在培養3周后,葉片中的葉綠素含量大于對照組,陸志強[40]也通過芘和萘對秋茄幼苗的脅迫中發現了對葉綠素的促進效應,在與本實驗結果相似。京春娃等白菜品種中的葉綠素含量呈現中低濃度芘脅迫下降,高濃度上升的變化趨勢,變化不顯著。楊志峰等[41]通過芘對辣椒的脅迫實驗中,發現芘濃度為50 mg/kg時葉綠素含量達到最小值,而中高濃度脅迫下葉綠素略有增加,與本實驗結果一致。賴聞玲等[42]研究菖蒲在萘脅迫下的生理影響時發現隨時間推移菖蒲逐漸適應萘污染,葉綠素恢復正常水平,推測本實驗中白菜在高濃度芘脅迫下生長能夠逐漸適應,葉綠素開始升高。有研究[43]表明,脯氨酸是植物體內的滲透調節物質,會隨著芘濃度的增加而急劇增長,能夠緩解芘脅迫下對細胞的傷害使葉綠素含量升高。

4 結論

(1)華北地區11種白菜在中低濃度(5、15、45 mg/kg)的芘脅迫下,生物量未顯著下降甚至出現升高的現象,說明白菜在中低濃度芘污染的土壤中對其生長抑制作用較小,而在高濃度(135、405 mg/kg)脅迫時不能夠正常的生長。

(2)除京翠60、京翠70和京春綠外,其余8種白菜MDA含量在中低濃度的脅迫下變化無顯著性差異,也說明白菜在中低濃度下受到細胞損害較小,其中京春娃二號、京春白和中白50即使在高濃度芘脅迫下與對照組相比,MDA含量也未有顯著增加,推測其對芘的耐受性較好。

(3)11種白菜中葉綠素a含量均大于葉綠素b含量,且在不同芘濃度的脅迫下兩種葉綠素具有相似的變化規律和顯著性,即芘對白菜葉綠素a和b的脅迫作用相似。在中低濃度芘脅迫下,京翠60、京翠70和京春綠葉綠素含量顯著升高,京春娃二號葉綠素含量顯著降低。其余7種白菜品種均變化不顯著,且在高濃度脅迫中有升高的趨勢,與植物自身抗性的閾值有關[41],具體機制還有待進一步研究。

大部分白菜在中低濃度的土壤芘脅迫下受到影響較小,高濃度脅迫下受到損傷無法正常生長。其中,京春白和中白50對芘的脅迫具有良好的耐受性,生理指標變化較小；京翠60和京春綠對于中低濃度芘脅迫下較為敏感,生理指標變化較大,可以作為中低濃度芘污染土壤的指示作物；高濃度芘處理下,京秋65、吉紅308的生理指標變化顯著,可以作為高濃度芘污染土壤的指示作物。