羊乳制品中摻雜牛乳鑒別技術研究進展

李婧妍，安樂，韓波，張瑞雪，張靜雅，2

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院農業農村部食品質量監督檢驗測試中心，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌 712100）

0 引 言

羊乳富含多種維生素、礦物元素、短鏈脂肪酸以及大量的乳清蛋白，其所含有的蛋白結構成分與母乳基本相同，被營養學界稱為“奶中之王”。其乳脂肪球微粒小、乳糖含量低，易于被人體吸收，長期飲用不會導致肥胖。羊乳還含較少的致敏性αs1-酪蛋白（αs1-CN）和乳球蛋白（β-Lg），可作為牛乳不耐受人群或胃腸較弱和體質較差嬰兒的良好乳源[1]。但羊乳及其制品的成本比牛乳高很多，兩者價格相差大概一倍。在利益驅動下，羊乳、羊酸奶、羊奶粉和羊奶酪等制品中摻雜牛乳現象非常普遍，這對一些牛乳過敏者可能造成傷害，也嚴重影響羊乳市場健康發展。要杜絕這種乳源摻假現象，關鍵問題之一是要建立快速準確的鑒別手段。目前，鑒定羊乳及其制品中是否摻雜牛乳的檢測方法主要依據兩者蛋白質、DNA分子和脂肪酸組成等特征指標構建，所涉及的檢測技術包括電子鼻法[2]、光譜法[3]、酶聯免疫法（EILSA）[2-8]、PCR法[9-26]、電泳法[27-33]、色譜及色譜-質譜法[34-37]和蛋白質組學法等[38-42]。其中ELISA法、PCR法、電泳檢測法、色譜及色譜-質譜法和蛋白質組學法是近年來鑒偽能力最為精確、檢測手段最先進的方法，本文綜述了這5種鑒別方法的特征和適用性，旨在為后續研究提供參考。

1 ELISA檢測技術

ELISA方法是基于牛源蛋白抗原特異性實現的，因此牛源性抗原的選擇是方法建立的關鍵。乳蛋白以酪蛋白和乳清蛋白為主，其中乳清蛋白由β-乳球蛋白（β-Lg）、α-乳白蛋白(α-La)、血清白蛋白（BLA）、免疫球蛋白（IgG）和乳鐵蛋白等組成；酪蛋白（CN）由αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN組成。抗原的選擇一般要求在牛乳中豐度高且穩定，一般選擇αs1-CN、β-CN、IgG等單一蛋白分子，且需具有較高的種屬特異性決定簇，即牛源性抗原產生的抗體不會與其他種屬抗原結合，只專一性結合牛乳中的蛋白。

抗體的制備是建立ELISA的另一個關鍵，包括多克隆抗體和單克隆抗體兩類。通常認為羊抗牛適合檢測羊乳中的牛乳成分，因為羊的免疫系統對自身抗原免疫耐受，因此羊抗牛抗體不會交叉結合羊乳蛋白。Anguita[4]和Hurley[5]等分別用牛β-CN和IgG制備牛源性單克隆抗體并建立間接ELISA反應體系，專一性結合牛源蛋白，其最低可檢出0.5%的摻假率。薛海燕[6]和Song[7]等將制備的牛β-CN多克隆抗體與羊β-CN進行免疫吸收封閉，以提高抗體特異性，制備的多克隆抗體均可特異性識別牛β-CN的某些特異性表位，且對牛α-CN、κ-CN和乳清蛋白無交叉活性，摻假牛乳的最低檢出量在2%～4%之間，且熱處理對制備的抗體也無顯著影響，表明該方法在滅菌乳的檢測中同樣適用。在多克隆抗體研究中，張世偉[8]等以牛IgG和其Fc片段為抗原，制備抗牛IgG的多克隆，并將以此蛋白作為包被抗體構建雙抗夾心ELISA方法。該方法無需復雜的前處理即可準確檢測牛乳含量，方法靈敏度可達到0.1μg/mL。ELISA技術具有高靈敏、高特異性、快速等優點，不需昂貴儀器設備，特別適合對大量樣品的篩檢，如果ELISA試劑盒的研發成功，可推廣到小型乳品企業和基層實驗室，提高檢測效率，降低操作人員工作難度。但ELISA分析也存在之一些缺陷，例如對試劑的選擇性高，且對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應等。

2 PCR檢測技術

ELISA檢測在生鮮乳中應用效果較好，但市售的乳制品大多經過高溫高壓處理，并添加多種食品添加劑，導致蛋白質結構和穩定性發生改變，特有蛋白或抗原決定部位也發生相應改變。而以動物種屬間遺傳信息差異作為物種鑒別靶標的PCR檢測法具有良好的耐高溫性，不僅可以檢測原料乳，也可檢測加工處理后的的高溫滅菌乳、酸乳和乳酪等制品。泌乳過程中脫落到乳中的體細胞（1×104～1×107/mL）內含有遺傳物質DNA，可提供乳源的有效信息。羊乳制品引入牛源成分的同時也引入該種屬特異性遺傳物質，因此可通過樣品中是否存在牛源PCR產物進行摻偽鑒定[9]。Plath等[10]最先將PCR方法用于羊乳和羊乳干酪中牛源成分的鑒定，在對基因組DNA中β-CN部分序列擴增時發現，山羊和綿羊乳β-CN DNA中存在牛乳不存在的限制性內切酶位點，如果摻雜了牛源成分，在選擇性限制酶分析和PAGE后，牛源性樣品中未被消化水解的β-CN會出現譜帶，該方法最低可檢出0.5%牛源成分。

利用限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應（PCR-RFLP）技術，Abdel-Rahman[11]等人建立了綿羊乳源中水牛乳和普通牛乳的鑒定方法。不同種屬的生物個體DNA序列存在差別，PCR-RFLP技術是利用同一種限制性內切酶切割下不同物種DNA序列，產生不同長度大小、不同數量的限制性酶切片。

水牛和普通牛乳擴增出603 bp大小的基因片段，羊乳擴增出374 bp大小的特異性條帶。該技術還可對水牛乳和普通牛乳進行進一步鑒定，對兩種牛乳線粒體細胞色素b（cyt-b）擴增產物進行酶切，發現水牛乳經限制性內切酶Taq I酶切PCR產物后，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測出兩條明確酶切條帶（191 bp和168 bp的片段），而普通奶牛乳沒有被酶切，條帶仍然為603 bp。因此，可根據是否存在這兩條酶切條帶準確進行種屬鑒定，最低可檢出綿羊和山羊干酪中摻入0.5%牛源成分。Lanzilao等[12]同樣用PCR-RFLP和瓊脂糖凝膠電泳結合對cyt-b基因進行擴增，可鑒定混合乳中奶牛、水牛、山羊和綿羊乳成分。

在目的基因選擇方面，很多研究認為線粒體DNA（mt DNA）比核基因組DNA更適合物種鑒定。因為mt DNA基因組結構在物種間高度保守，一級結構有很大差異，并且在細胞中的復制數量較多，可得到有效擴增，更適合于物種的鑒定研究。另外，線粒體特異序列區（D-環區、cyt-b）和保守序列區（12SrRNA，16SrRNA）也常用來作為目的基因。Maudet[13]、De[14]、Bania[15]和López-Calleja[16]等分別設計牛種屬特異性探針對線粒體D-環區、cyt-b和12S rRNA進行擴增，產物經瓊脂糖凝膠-EB染色后，其牛乳檢出限均可達到0.1%以上。

多重PCR檢測技術也是檢測食品摻假的有效手段，該技術在同一PCR體系中加入不同種屬特異性基因的特異性引物，可同時擴增多個模板的不同區域，得到相應的而不同長度的PCR產物，以此來檢測目標物是否存在。Kotowicz[17]、Botter[18]和López-Calleja[19]等在同一PCR管中均實現了對普通牛乳、山羊乳和綿羊乳線粒體保守序列區（12S rRNA和16S rRNA）特異性片段的同時擴增，建立了3種乳源的多重PCR快速檢測方法。在靈敏度方面，多重PCR與單重PCR具有相同的檢測靈敏度。

經過高溫處理的乳制品，其DNA降解為許多僅有幾百個堿基的小片段，如果檢測目的片段太大，可能無法發現陽性片段，而受電泳檢測有效性的限制，傳統PCR難以采納小片段目的產物。實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實現整個PCR過程的實時監測，在擴增的指數期對起始模板進行定量分析，對小片段目標產物可以準確定量。RT-PCR法不但具有常規PCR敏感度高、污染概率小等優點，同時也可通過一次擴增同時檢測多個靶標基因。另外，實時定量PCR不需要對PCR產物進行凝膠電泳，可快速、高通量擴增，在檢測動物源性成分中得到廣泛的應用。目前，熒光標記的方法有兩種，非特異性熒光標記（SYBR Green I法）和特異性熒光標記（Tapman探針法）。

SYBR Green I是一種與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，產生的熒光信號和雙鏈DNA分子數成正比，具有快速、靈敏、低成本和高通量等優點。Liao等[20]設計牛特異性探針12SBT-REV，對線粒體12SrRNA序列中346 bp進行擴增，產物用瓊脂糖電泳和熒光SYBR Green RT-PCR進行鑒定。Agrimonti等[21]基于該染色法，使用四重實時定量PCR技術建立了可同時鑒定鮮乳和干酪中奶牛、山羊、綿陽、水牛4種乳源的快速定性方法，并可對其中奶牛DNA進行定量，定量限為0.1%。

Taqman法是用特異性熒光探針識別和檢測擴增產物，所得數據更為精確。該研究大多參照牛、山羊和綿羊線粒體基因組中高度保守的16S rRNA、12S rRNA、cyt-b的種內保守中間特異性區域作為牛羊特異檢測的靶序列，設計樣品通用引物序列和特異分子信標探針后（常用的探針有FAM、HEX熒光探針、淬滅基團為TAMRA），通過優化反應體系中的引物濃度、探針濃度和退火溫度等條件，建立能同時檢測羊牛乳成分的熒光定量PCR體系[22-25]。這類方法對純DNA含量的最低檢出濃度為0.01 ng，對羊奶中摻入牛奶和豆漿的體積摻假檢測靈敏度均為0.1%。也有研究不提取DNA[26]，經核酸釋放劑處理后，直接進行熒光定量PCR檢測鑒定羊奶粉中的牛源性成分。

PCR檢測技術是羊奶摻假研究最多的檢測方法，具有通量大、靈敏度高、特異性好等優點。傳統PCR法需對PCR產物進行凝膠電泳才能完成整個檢測，一旦遇到可疑陽性結果，必須進行酶切鑒定。實時熒光定量PCR不需后處理，克服了普通PCR假陽性問題和交叉污染，也不受摻假形式的影響，可自動實時檢測分析，已在動物源性成分檢測項目上取代一般PCR方法成為最為常用的分子生物學檢測的手段。熒光PCR技術在乳源檢測的運用過程中也受到一些限制，主要是因為各種乳品經過不同程度的深度加工，其中所含有的DNA成分遭到不同程度的破壞，并且在生產過程中混入不同的添加劑和佐料，使食品的成分更加復雜。

3 電泳檢測技術

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）具有分子篩效應，能夠有效分離乳中主要蛋白質，可依據不同乳源蛋白分子量差異同時進行定性和定量分析。Pesic[27]以全乳和乳清蛋白為樣品，以牛源β-Lg、α-La為目標物，利用未變性-PAGE技術比較混合牛羊乳中電泳條帶強度，對牛乳含量進行分析，結果顯示牛乳在山羊奶中檢出限為3%，在綿羊奶中為5%。阿力木等[26]以不同乳源的乳清蛋白為樣品，利用SDS-PAGE電泳技術分離乳清蛋白，確定羊乳與牛乳差異性蛋白為乳鐵蛋白，并通過灰度分析定量摻偽比率。然而，PAGE具有一定的局限性，耗時長、勞動強度大，且對小分子物質的檢測能力弱。

毛細管電泳（CE）是基于被分離物質的荷質比差異，在電場力作用下，可根據目標物在緩沖溶液中的遷移速度不同實現分離。對于結構相似但電荷不同的多肽蛋白，通過調節pH值、改變溶質電荷和淌度達到分離目的。CE技術能夠快速、可靠地分離乳中酪蛋白和乳清蛋白，且僅使用少量樣品和緩沖液即可獲得高分辨率和良好的定量結果，已成功應用綿羊和山羊乳中摻雜牛乳的鑒定[29]。Trimboli[30]、劉鳴暢[31]、Muller[32]等建立了不同的緩沖體系，通過CE蛋白遷移圖譜選擇目標蛋白進行摻假定量分析。Cartoni和Trimboli等在pH 9.0-10.0的硼酸鈉緩沖環境中分別分離出牛β-Lg A和αs-CN為特征目標物；劉鳴暢等建立了2%SDS緩沖液體系，發現牛乳中β-CN可作為牛乳目標物，可鑒定嬰幼兒配方羊乳粉、乳清粉中0.5%的牛乳摻雜量。Muller等在高離子強度的酸性環境（pH 1.9），以非牛β-Lg在牛羊混合乳中的比例為基礎，結合質譜聯用技術建立了測定牛乳摻假量的方法。

等電聚焦電泳法（IEF）也可用于乳制品摻假，其原理是通過兩性電解質建立一個pH梯度環境，電泳時蛋白質遷移到其相應的等電點的pH處形成區帶，從而實現目標物分離。[33]等用IEF法檢測羊乳干酪中牛乳摻假，對酪蛋白進行分離后，對β-Lg水解產物γ-CN進行等電聚焦，可定量檢測牛乳中γ-CN含量，檢出限為1%。該方法在新鮮干酪和熱加工再制干酪中均具有較高的鑒偽能力。與其他檢測技術相比，電泳法具有分離模式多、分析時間短、分辨率高，樣品和試劑消耗極少等優點。但電泳分析法操作繁瑣費時，需對電泳條帶分析以表明各種蛋白質的相對分布，對目標蛋白的定量難以精確，且制備能力差。但如果能在電泳技術基礎上研發檢測試紙，則可作為初步鑒定摻偽乳源的手段。

4 色譜及色譜-質譜聯用技術

色譜及色譜-質譜聯用技術在摻假鑒定中主要通過對乳蛋白進行定性識別。單獨使用色譜技術分析時，目標物為牛羊乳中不同的酪蛋白，主要依據α-CN、β-CN和κ-CN在反相HPLC中和固定相結合能力不同進行分析。Veloso[34]等利用HPLC定量分析生牛乳、綿羊乳和山羊乳中α-CN、β-CN、κ-CN含量，指出牛羊乳中α-CN含量存在顯著差異，該方法可對摻雜了5%牛乳的羊乳進行定量。作者還對該方法在干酪成熟30 d過程中的穩定性進行了分析，結果穩定可靠。Natercia等[35]用疏水色譜法（HIC）對生牛乳、山羊乳和綿羊乳及其乳酪制品中αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN進行分離，通過對αs1/κ-CN、αs2/β-CN、β/κ-CN和αs1/αs2-CN峰面積比值對摻雜比率進行分析，其檢出能力最低為2%。

色譜-質譜聯用技術中，首先依托HPLC對乳蛋白進行分離，再利用蛋白圖譜特征指標變化結合基質輔助激光解吸電離-飛行之間質譜（MALDI-ToF）或電離質譜（MALDI-MS）等技術聯用實現。質譜技術所需樣品量小，能夠檢測到相當高的肽段數量和氨基酸序列，在蛋白質識別和定量方面具有較高的可信度和靈敏度。Nicolaou等[36]利用MALDI-ToF-MS技術對牛乳、山羊乳和綿羊乳分別進行蛋白圖譜掃描，用偏最小二乘法和非線性核最小二乘法對牛乳摻入羊乳比例與蛋白譜圖中特征指標變化趨勢的相關性進行分析，發現羊乳中摻雜牛乳比率與這些特征指標的變化呈正相關。在判定山羊乳中牛乳含量時，以蛋白譜圖中β-Lg與α-La比值作為特征指標；判定綿羊乳中牛乳含量時，以綿羊乳中特有的γ2和γ3酪蛋白為特征指標，該方法最小可檢測5%摻雜比率。對于質譜法經常出現的基質效應問題，Ke等[37]用同位素內標法對基質效應進行補償，以4種酪蛋白（αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN）和兩種乳清蛋白（β-Lg、α-La）為目標物，用HPLC-MRM技術篩選其水解特征肽段作為摻假標志物，對特征肽進行了定性和定量分析，該方法在山羊乳和綿羊乳乳清蛋白粉和嬰幼兒配方奶粉中摻假牛乳目標蛋白檢出限0.01～0.05 g/100g，回收率82.3%～116.6%。

超臨界流體色譜-四級桿飛行時間質譜（SFC-Q-TOF-MS）聯用技術也成功應用于摻偽鑒定中，主要依據游離脂肪酸酯化到甘油分子骨架的不同位置，通過分析牛羊乳中復雜的甘油三酯（TAG）組成來判斷乳源類型[38]。乳脂中的三酰甘油成分復雜，采用標準品定性困難，而通過Q-TOF-MS提供的精確質量數與豐富的碎片信息識別牛羊乳中TAG組成差異則是一種快速鑒定手段。該方法共鑒定出55種TAG，其中牛乳48種，羊乳53種，并指出其酰基鏈總碳數和雙鍵數量均存在差異。其中羊乳中短鏈TAG和長鏈TAG含量較牛乳多，且不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸含量）較高。應用主成分分析法（PCA）處理SFC-MS數據發現，兩種樣品較好地分布在兩個區域，表明其存在較明顯的差異。其中區分羊奶樣品的重要TAG指標為：O-P-O、O-P-C、O-P-L、O-S-O和P-Co-C；區分牛奶樣品的重要TAG指標為：P-P-Co、O-P-Co、O-M-Co、O-Bu-O和O-P-P。

與其他技術相比，色譜質譜法的優勢是不可替代的，檢測方法的高通量是摻假快速檢測的最佳選擇，而且色譜和質譜法的操作也越來越智能化。且針對牛乳過敏人群的產品，尤其是嬰幼兒配方羊乳粉產品的檢測中，利用色譜和質譜技術進行痕量分析是十分必要的。但色譜質譜研究的最大問題在于食品復雜的基質對儀器的靈敏度有很大影響。另外，色譜和質譜類儀器昂貴，前處理操作復雜，對分析操作人員要求較高，僅適合用于大型乳品企業和監管部門等進行摻偽鑒定。

5 蛋白組學檢測技術

蛋白組學作為后基因時代的一個新的研究手段迅速發展，已成為鑒別各類功能性食品或高附加值食品真偽的有力研究工具。目前，蛋白質組學技術已被成功應用到乳及乳制品摻假研究，主要還是通過對乳清蛋白（β-Lg、α-La）和4大酪蛋白家族（αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN）進行分離鑒定。牛羊乳種屬間差異乳蛋白進行組學研究，不僅可對乳源蛋白含量及變化進行鑒定，也可對乳蛋白的糖基化、磷酸化等翻譯后修飾的改變進行特征性描述。Stepanka等[39]比較了MALDI-TOF-MS和LC-ESI-TOF技術在乳源摻假中的鑒定能力，并結合主成分分析法和蛋白數據庫對捷克市場上常見的27種羊乳干酪的真實性進行了鑒定。結果發現MALDI-TOF法僅能區別部分摻假樣品，而應用LC-ESI-TOF技術發現牛α-s-CN的特異性序列可作為標記物鑒定羊乳中是否摻雜牛乳。

Camerini[40]等用MALDI-MS和LC-MS/MS技術聯合檢測水牛、綿羊和山羊乳清制作的Ricotta干酪中摻雜奶牛乳的含量。將提取的乳清干酪蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳分離，胰蛋白酶水解，獲得的多肽溶液經反相HPLC-MS/MS技術進行定性和定量分析。發現奶牛乳β-LG的C-末端肽（LSFNPTQLEEQCHI，m/z 858.4）與其他乳源均有差異，且在質譜中響應值高，可作為奶牛乳清的特異性肽，其最低檢出能力為0.5%。Chen等[41]同樣以β-Lg作為目標蛋白，同樣發現牛（LSFNPTQLEEQCHI，m/z 858.6/462.2）和羊（LAFNPTQLEGQCHV,m/z807.5/600.2）種屬特異性肽可分別作為區分牛羊乳的指標。Bernardi[42]等使用Up-down分離法和HPLC-MS/MS結合的蛋白質組學技術篩選出山羊乳、綿羊乳、水牛乳和奶牛乳的種屬特異性肽。用胰蛋白酶直接水解全乳樣品，經HPLC-MS/MS鑒定和Mascot軟件分析蛋白水解肽的組成和分子量，發現αs1-CN gi/311943的一個肽段（YLGYLEQLLK，m/z 620.3）可作為山羊乳水解肽的標記物以區分綿羊乳和牛乳；另一個m/z830.9的未知蛋白肽段（MSHLVLSNVGISFTR）可作為牛種屬特異性肽作為判斷摻假的標記物。該方法在干酪生產加工和后熟過程中同樣適用。蛋白質組學能為乳源鑒偽提供系統性信息，不僅能夠用于乳源鑒偽，還能用于乳源品質認證，是鑒偽工作中最為精準的技術手段，可作為仲裁和出入境檢測過程中的有效工具。該方法的局限性是檢測成本和對檢驗人員的技術要求很高，且儀器設備的使用和后期維護產生較大的費用。

6 結 論

本文從檢測的目標成分、檢測手段、結果靈敏度以及檢測效率等方面對羊乳中摻雜牛乳的檢測方法進行了論述。ELISA和電泳技術有著較高的準確度，如能依據其反應原理制成檢測試劑盒或試紙，則可用于生產過程批量定性檢測。但試劑盒或試紙的研發需要投入大量的精力，需要研究人員付出很多的努力。PCR檢測方法以DNA檢測為依據，靈敏度和特異性均較高，可檢出痕量牛乳含量。但該方法前處理時間較長，不適用于快速檢測，一旦樣品感染乳腺炎，體細胞數量易受到炎癥污染，將無法進行鑒定。色譜-質譜技術以及蛋白組學技術是當今發展最快、也是最為準確的檢測手段。這類技術是以牛羊乳蛋白之間結構和性質差異為依據，并基于這些差異性進行分離、區別和鑒定，可反應乳蛋白各種特征的真實情況，具有其他研究方法不可取代的優勢。文中總結的5種研究方法、技術手段以及適用性各不相同，旨在為羊乳摻假檢測研究提供更多的思路，使乳源鑒偽研究不局限于單一研究方法和單項檢測結論，且在鑒定過程中，也很可能需要多種檢測方法相互輔助才能得到可靠的實驗結論。