甘薯莖葉多酚類物質的組分構成及抑菌活性

霍錦雙，隋偉策，孫紅男，木泰華

(1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052；2.中國農業科學院農產品加工研究所/農業農村部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193)

0 引 言

【研究意義】我國甘薯種植面積約337.31×104hm2及年產量0.72×108t均居世界首位[1]。甘薯地上部分的莖葉資源也同樣豐富，由于一年中可多次采收，產量與地下塊根相當[2]。除少量食用或被作為動物飼料外，大部分甘薯莖葉都被丟棄，造成了資源浪費。【前人研究進展】甘薯莖葉富含多酚類物質，總酚平均含量6.00 g/100 g DW，是參比蔬菜(菠菜、甘藍等)的2～3倍[2]；氧自由基吸收能力是茶多酚、葡萄籽多酚和水溶性VE的1.3、1.3和2.8倍，超氧陰離子清除活性分別是抗壞血酸、茶多酚、葡萄籽多酚的3.1、5.9和9.6倍[2]。王世寬等[3]研究發現，甘薯莖葉中的綠原酸粗提液對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，最小抑菌濃度范圍在200～1 000 μg/mL。羅藝晨等[4]研究發現，綠原酸主要是通過改變金黃色葡萄球菌細胞膜的通透性，促使大量的β-半乳糖苷酶外漏，改變細菌細胞的能量代謝以實現對細菌的抑制作用。【本研究切入點】目前關于甘薯莖葉多酚抑菌活性的研究主要集中在多酚粗提物或綠原酸類物質，且主要針對常見細菌(如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌等)，針對霉菌的抑制作用研究較少。研究純化后甘薯莖葉多酚及其各單一組分抑菌活性。【擬解決的關鍵問題】采用超聲波輔助乙醇溶劑法結合AB-8大孔樹脂法對甘薯莖葉多酚提取純化，應用反相高效液相色譜對其組成及各組分含量進行分析，采用牛津杯法和最小抑菌濃度法，研究純化后的甘薯莖葉多酚及其各單一組分對常見細菌和霉菌的抑制作用，為甘薯莖葉多酚作為天然抑菌劑的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 甘薯品種

甘薯莖葉品種商薯19號(淀粉加工型甘薯品種)，采收于2016年9月，由山西東寶薯業有限責任公司提供。采收后立即挑選新鮮無病斑、無腐爛甘薯莖葉，洗凈晾干，經真空冷凍干燥后備用。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)、米根霉(Rhizopusoryzae) 、米曲霉(Aspergillusoryzae)購自中國微生物菌種保藏管理中心。

咖啡酸(caffeic acid, CA)，4-O-咖啡酰奎寧酸(4-O-caffeoylquinic acid, 4-CQA)，5-O-咖啡酰奎寧酸(5-O-caffeoylquinic acid, 5-CQA)，3-O-咖啡酰奎寧酸(3-O-caffeoylquinic acid, 3-CQA)，3,5-O-二咖啡酰奎寧酸(3,5-di-O-caffeoylquinic acid, 3,5-CQA)，3,4-O-二咖啡酰奎寧酸(3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 3,4-CQA)，4,5-O-二咖啡酰奎寧酸(4,5-di-O-caffeoylquinic acid, 4,5-CQA)，3,4,5-三咖啡酰奎寧酸(3,4,5-tricaffeoylquinic acid, 3,4,5-CQA)：美國APExBIO技術有限公司；蘆丁：法國Extrasynthese公司；二甲基亞砜：北京索萊寶科技技術有限公司；刃天青：北京索萊寶科技技術有限公司；AB-8大孔樹脂：北京索萊寶科技技術有限公司；營養肉湯：北京陸橋技術有限責任公司；營養瓊脂：北京陸橋技術有限責任公司；麥芽浸粉瓊脂：北京陸橋技術有限責任公司；所有分離試劑均為國產。

1.1.2 儀器與設備

LCQ液相色譜-質譜聯用儀：配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur1.2數據處理系統，美國Finnigan公司；HP 1100高效液相色譜系統：配有可變波長紫外檢測器和Rev.A.06.03色譜工作站，美國惠普公司；FD5-3真空冷凍干燥機：美國SIM公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；GL-21M高速冷凍離心機：湘儀儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津。

1.2 方 法

1.2.1 提取甘薯莖葉粗多酚

稱取1 g的樣品加入20 mL 70%的乙醇，超聲波在50℃，53 KHz的條件下超聲30 min，在7 000 g，20℃的條件下離心10 min，收集上清液，上述步驟重復3次，合并4次浸提的上清液，45℃旋轉蒸發去除乙醇，用蒸餾水定容至1 000 mL，每個樣品各取30 mL作為粗提液，置于4℃層析柜中備用。

1.2.2 大孔樹脂的預處理

AB-8大孔樹脂預處理方法參照Xi等[2]。首先，稱取250 g的AB-8大孔樹脂，加入1 000 mL的95%乙醇溶液浸泡24 h，蒸餾水進行沖洗。之后加入1 000 mL的2 mol/L的NaOH溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性，再加入1 000 mL的2 mol/L的HCl溶液，浸泡4～6 h，用蒸餾水洗至中性，過濾水分后備用。

1.2.3 純化甘薯莖葉多酚

純化甘薯莖葉多酚參照Xi等[2]的方法，并稍作修改。稱取50 g預處理好的AB-8樹脂，置于250 mL錐形瓶中，加入200 mL甘薯莖葉多酚粗提液。將錐形瓶置于恒溫震蕩器中，25℃、100 r/min震搖至吸附平衡。吸附飽和后用蒸餾水清洗3次去除樹脂上的雜質后，用70%(v/v)乙醇溶液對吸附飽和后的樹脂進行靜態解吸直至溶液無色。將所得溶液45℃旋轉蒸發去除乙醇后，在-39℃超低溫冷凍冰箱中預凍12 h，之后將預凍好的甘薯莖葉多酚放置于真空冷凍干燥機中干燥72 h，得到純化甘薯莖葉多酚，儲藏在4℃冰箱中。

1.2.4 總酚含量

樣品總酚含量采用福林酚比色法[2]，稱取0.10 g的樣品用蒸餾水定容至100 mL，取0.5 mL加入1.0 mL稀釋10倍的福林酚試劑，30℃反應30 min，之后加入2 mL 10%(w/v)的碳酸鈉溶液，30℃反應30 min，在736 nm下測定吸光值。用紫外分光光度計在736 nm處測定吸光光度值。標準曲線y=8.767 1x+0.006 8，R2=0.999 4。樣品總酚含量表示為g綠原酸當量(CAE)每100 g干重(g CAE/100 g DW)。

1.2.5 高效液相色譜

采用SHIMADZU LC-20A液相系統對純化后的甘薯莖葉多酚進行定性定量分析，該系統配備了LC-20A二級管陣列檢測器，SPD-20A波長紫外檢測器，aSIL-20A自動進樣器，CTO-20A柱加熱器。色譜柱為Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm; 5 μm粒徑)，柱溫為30℃。流動相為0.5%(w/v)磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序為：0～15 min：20%～65% B，15～15.1 min：65%～80% B，15.1～20 min：80% B，20～21 min：80%～20% B，21～26 min：20% B，流速為1 min/mL，進樣量為20 μL，酚酸類物質檢測波長為326 nm，蘆丁檢測波長為340 nm。標準品(5 mg)溶于5 mL 80%無水甲醇溶液制備為母液(1 mg/mL)，冷藏于層析柜中備用。用80%甲醇將各標準品母液稀釋50.0 μg/mL，并配制為0.5、1.0、5.0、10.0和50.0 μg/mL的混合標準品溶液，過0.2 μm膜后用于色譜分析。用80%的甲醇溶解純化所得的甘薯莖葉多酚，配制濃度為200 μg/mL，過0.2 μm膜，據樣品色譜圖中各吸收峰的保留時間和峰面積對樣品中各組分進行定性定量分析。

1.2.6 甘薯莖葉多酚及其單體對微生物生長的影響

樣品預處理 將多酚及各單體標品溶入含二甲基亞砜(1%)的生理鹽水中，將其濃度配到1 mg/mL，用2倍稀釋法將其稀釋到0.500、0.250和0.125 mg/mL。頭孢曲松鈉和山梨酸鉀(1 mg/mL，w/v)作為陽性對照組，生理鹽水(1%二甲基亞砜)為陰性對照組。

復活菌種：將所有凍干菌株移接入含營養肉湯的無菌試管中，細菌置于37℃恒溫培養箱中培養24 h，霉菌在30℃培養48 h，存放于4℃條件下備用。

菌懸液的制備 用接種環挑取一環菌體或孢子放入30 mL生理鹽水里，搖勻，制成菌體懸液或孢子懸液備用。

抑菌活性： (1)采用牛津杯法[5]測定抑菌活性。20 mL無菌液體營養瓊脂倒入每個培養皿中，等到冷卻凝固之后，將100 μL的細菌/霉菌懸浮液擴散到其表面上，用無菌接種環涂布均勻形成菌苔。放入無菌牛津杯，杯中加入200 μL不同濃度的樣品。細菌在37℃的條件下培育24 h，霉菌在30℃的條件下培育48 h。測定抑菌群的直徑來評估其抗菌活性。每一個樣品重復做3次，取3次抑菌圈直徑的平均值。(2)最小抑菌濃度的測定。參照Vodnar[6]等的方法，使用96孔板進行連續稀釋。20 μL不同濃度(1 500，750，375，188，94和 47 μg/mL)的樣品溶液加入到含100 μL營養肉湯的96孔板中，之后，每個孔中加入10 μL菌懸液。含細菌懸液的96孔板在37℃的條件下培養24 h，真菌懸液的96孔板在30℃的條件下培養48 h。每個孔中加入20 μL(0.2 mg/mL)的刃天青溶液來測定樣品的最小抑菌濃度，之后平板在37℃的條件下培養30 min。當顏色由藍色變成粉紅色時表明刃天青含量減少，此時為細菌生長。加入最低濃度能防止顏色變化為最小抑菌濃度。

1.3 數據處理

用Duncan's 新復極差法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 甘薯莖葉多酚組成

研究表明，商薯19號甘薯莖葉中總酚含量為6.3 g CAE/100g DW，經提取純化后的多酚類物質呈棕黃色無定型粉末，純度為84.32%±3.64%。

8種物質分別是7種綠原酸類物質(即咖啡酸與奎寧酸酯化而成的各類化合物)和咖啡酸。HPLC吸收圖譜是蘆丁。這9種單體的保留時間均在前10 min。商薯19甘薯莖葉多酚中3種雙取代的咖啡酰奎寧酸含量較高，其中4,5-CQA的含量最高為40.18%，其次為3種單取代的咖啡酰奎寧酸，平均含量2.47%。3,4,5-CQA、咖啡酸和蘆丁含量較低，分別為0.86%、0.24%和0.79%。圖1，表1

圖1 純化所得商薯19號甘薯莖葉多酚中(a)酚酸類物質和(b)蘆丁的HPLC吸收圖譜Fig.1 The HPLC chromatography of (a) phenolic acids and (b) rutin in sweet potato leaf polyphenols

表1 純化所得商薯19號甘薯莖葉多酚的組分構成Table 1 The individual phenolic composition of polyphenols purified from Shangshu No.19 sweet potato leaves

2.2 甘薯莖葉多酚及其各組分對不同菌的抑制作用

研究表明，各樣品對6種病原菌均有抑制作用，其抑制強度為革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)>革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、普通變形桿菌)>霉菌(米曲霉和米根霉)，且各樣品的抑菌強度與計量呈正相關。

同一樣品對不同菌的抑制作用不同，且同一提取物的不同組分對同一菌的抑制作用亦不同。在樣品濃度為1.00 mg/mL時，各組分對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小為：咖啡酸=總酚>雙咖啡酰奎寧酸類=3,4,5-CQA>咖啡酰奎寧酸類=蘆丁；對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑大小為咖啡酸=總酚>雙咖啡酰奎寧酸類>咖啡酰奎寧酸類>3,4,5-CQA=蘆丁；對大腸桿菌的抑菌圈直徑大小為咖啡酸=4,5-CQA>其他單體；對普通變形桿菌、米曲霉、米根霉抑菌圈直徑最大的均為咖啡酸。甘薯莖葉多酚提取物中咖啡酸的抑菌作用最強。 表2

表2 多酚及其各組分對不同菌的抑菌圈大小(抑菌圈直徑(mm))Table 2 Antimicrobial diameter of different microorganisms of phenolic compounds (the inhibitory diameter (mm))

續表2 多酚及其各組分對不同菌的抑菌圈大小(抑菌圈直徑(mm))Table 2 Antimicrobial diameter of different microorganisms of phenolic compounds (the inhibitory diameter (mm))

2.3 甘薯莖葉多酚及其各組分最小抑菌濃度的測定

研究表明，各樣品對6種病原菌的最小抑菌濃度為：革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌)<革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、普通變形桿菌)<霉菌(米根霉、米曲霉)，該結果與牛津杯法結果相一致。其中咖啡酸的抑菌作用最強，對6種病原菌的最小抑菌濃度范圍在47～188 μg/mL，對金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度相當于陽性對照的頭孢曲松鈉(47 μg/mL)。表3

表3 甘薯莖葉多酚及其各組分對6種菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentration of sweet potato leaf polyphenols to six microorganisms (μg/mL)

3 討 論

商薯19號甘薯莖葉的總酚含量為6.3 g CAE/100g DW，是金銀花葉的1.4倍[7]，甘藍、菠菜、芥菜的2～3倍[2]。通過高效液相法對純化后的甘薯莖葉多酚組成進行了分析，結果表明，其主要由9種多酚類物質組成，其中，3種雙取代的咖啡酰奎寧酸的含量較高，咖啡酸的含量最低。Jang等[5]的研究也表明甘薯莖葉多酚主要是4種雙咖啡酰奎寧酸類物質，但含量最高的為3,5-CQA，這可能是不同品種的甘薯莖葉中單體含量有一定的差異。

對純化后的甘薯莖葉多酚及其單一組分的抑菌活性進行分析，發現各組分對革蘭氏陽性菌抑制作用強于革蘭氏陰性菌，對霉菌的抑制作用最弱。相關研究表明，多酚類物質可通過改變病原菌細胞的疏水性或使其細胞膜出現孔洞，導致細胞膜成膜性產生不可逆的變化，使細胞內主要成分流失，從而起到抑菌作用[8]。而革蘭氏陰性菌的細胞壁相比于革蘭氏陽性菌更加復雜，外膜的脂多糖層可能限制了抑菌藥物進入[6,9]。霉菌的細胞壁與細胞膜緊密相連，且繁殖方式和細菌不同，因此，受抑菌物質作用最弱[10]。Mokhtar等[11]通過測量抑菌圈大小表明，酚類物質具有抑菌活性，其中，以咖啡酸的抑菌活性為最強(3.5～20.5 mm)，其次為槲皮素(4.8～13.5 mm)和山奈酚(7.0～14.0 mm)。Mokhtar等在對辣椒提取物的抑菌性研究中發現咖啡酸相比于蘆丁和香豆素具有更強的抑菌作用，且單體協同作用的抑菌效果更強[8]。蒼耳草及馬黛茶的提取液中咖啡酸對黃色葡萄球菌的抑制作用顯著強于其他酚酸類[10,13]。所有樣品中，總酚的抑菌作用僅次于咖啡酸單體，但顯著強于其它單一組分，這可能是甘薯莖葉多酚中所含的生物活性成分產生協同效應，因此，一定程度上增強樣品對病原菌的抑制作用[14,15]。Prasad等[16]的研究表明，單獨的酚酸類物質抑菌效果較弱，但是將其與另一種酚酸類物質組合后，其抑菌作用顯著增強。基于上述結果，結合各樣品的抑菌效果來看，甘薯莖葉總酚具有較強的抑菌性能，僅次于咖啡酸。這可能是甘薯莖葉多酚中所含的生物活性成分產生協同增效，共同抑制病原菌的效應。各樣品雖然對霉菌抑制作用不顯著，但是在高濃度下具有一定的抑制作用。表明甘薯莖葉有望成為天然抑菌劑的有效來源，仍需對純化后甘薯莖葉多酚及其各單一組分抑菌活性進行系統的研究。

4 結 論

純化后的甘薯莖葉多酚除前期已鑒定得到的咖啡酸及咖啡酰奎寧酸類物質外還含有蘆丁。各組分含量占比為：雙咖啡酰奎寧酸>單咖啡酰奎寧酸類>3,4,5-CQA>蘆丁>咖啡酸，且各單一組分對6種病原菌的抑制作用隨著劑量的增加而增強。其中咖啡酸對革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)的最小抑菌濃度(47 μg/mL)相當于陽性對照的頭孢曲松鈉，對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和普通變型桿菌)的最小抑菌濃度(94 μg/mL)僅次于陽性對照的頭孢曲松鈉(47 μg/mL)。咖啡酸含量最低但抑菌作用最強，可能是甘薯莖葉多酚中主要的抑菌成分；總酚的抑菌作用雖略低于咖啡酸，但是強于其他單體，可能是各單體在抑菌作用中存在協同作用；各樣品雖然對霉菌抑制作用不顯著，但是在高濃度下具有一定的抑制作用。