GKN2在胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制

廖雪洪，林賢東，潘 超，葉韻斌，陳 剛，林潔瓊，胡 丹，夏 言，鄭雄偉

胃癌是最常見的惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。胃癌屬于上皮來源腫瘤，由胃上皮細(xì)胞及祖細(xì)胞不斷克隆增殖形成[2-3]。幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)、EBV等外界因素引起胃黏膜屏障破壞導(dǎo)致的胃炎，已被證實(shí)是最常見“腸型”胃癌的危險(xiǎn)因子[4]。目前，胃炎向胃癌進(jìn)展的機(jī)制尚未清楚。胃動(dòng)蛋白家族(gastrokines, GKN)是一類特異性表達(dá)于正常胃黏膜上皮的分泌小蛋白，具有促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞分裂增殖和移行、保護(hù)胃黏膜和促進(jìn)受損黏膜修復(fù)的功能[5]。胃動(dòng)蛋白2(gastrokine 2, GKN2)作為GKN的重要成員之一，是胃黏液層的組成成分之一，其與TFF1在胃黏膜表面形成一個(gè)異源二聚體復(fù)合物，保護(hù)胃黏膜和促進(jìn)受損黏膜修復(fù)[5]。近期研究顯示，GKN2在清除HP和抑制胃癌細(xì)胞生長中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)探討GKN2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及可能機(jī)制，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2016年福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院存檔的8例胃癌及癌旁組織。胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901、MKN45、BGC-823、NCI-N87、MKN28均購自上海細(xì)胞庫。F12 HAM'S培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基(廈門Hyclone公司)；北美胎牛血清(美國GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國Life公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；FastStart Universal SYBR Green Master(美國Roche公司)；實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞功能分析檢測板(E-plate16)(福州世豪公司)。

1.2 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)LVCON238作為陰性對照病毒，過表達(dá)慢病毒載體GV358(圖1)，AgeI/AgeI酶切，購自上海吉?jiǎng)P基因公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901采用F12培養(yǎng)基，MKN45、MKN28、BGC-823、NCI-N87采用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，2～3天/次。將細(xì)胞消化接種于24孔板中，陰性對照組加入LVCON238病毒液2 μL、F12培養(yǎng)液250 μL、增強(qiáng)液250 μL、5 μg polybrene混勻培養(yǎng)；GKN2過表達(dá)組加入LV-GKN2病毒液25 μL、F12培養(yǎng)液250 μL、增強(qiáng)液250 μL、5 μg polybrene混勻培養(yǎng)。嘌呤霉素待陽性克隆形成，擴(kuò)大培養(yǎng)，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，分別命名為陰性對照組：AGS-CON、SGC-7901-CON，GKN2過表達(dá)組：AGS-GKN2、SGC-7901-GKN2，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表達(dá)，qRT-PCR及Western blot法驗(yàn)證GKN2的表達(dá)情況。

圖1 過表達(dá)慢病毒載體圖譜

1.4 方法

1.4.1qRT-PCR 收集穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，按照Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA用RevertAid First Strand cDNA Sythesis Kit按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μL的cDNA用Lightcycler 480 SYBR Green I Master按照試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR，擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)；GAPDH作為內(nèi)參基因。GKN2正向引物：5′-GCCTGATGTACTCAGTCAACC-3′；反向引物：5′-TAGTTCTCCACCGTGTCTCC-3′。GAPDH正向引物：5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′，GAPDH反向引物：5′-CCTGCTTCACCACCTTCT TG-3′，mRNA的相對定量采用2-ΔΔCt法。

1.4.2Western blot法 將細(xì)胞冰上裂解，超聲離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。3%BSA封閉1 h后分別加入稀釋好的一抗4 ℃過夜，TBST洗滌3次，加入二抗封閉120 min，TBST洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.4.3實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù) 使用RTCA S16系統(tǒng)進(jìn)行檢測，在E-Plate 16的孔中加入50 μL培養(yǎng)基，檢測基線，而后加入100 μL混合均勻的細(xì)胞懸液，置于超凈臺(tái)中室溫放置30 min，最后放入培養(yǎng)箱中的RTCA S16 Station，開始進(jìn)行細(xì)胞增殖的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測。

1.4.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，各取2 000個(gè)胃癌細(xì)胞接種到6孔板中，10～15天后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10～20 min，PBS洗滌，計(jì)算克隆數(shù)。

1.4.5劃痕實(shí)驗(yàn) 胰酶消化，接種到裝有劃痕愈合小室Culture-Insertu-Dish培養(yǎng)小盤，待長滿后棄原培養(yǎng)液，拔掉劃痕愈合小室，PBS浸洗，加入培養(yǎng)液，拍照；37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察創(chuàng)傷愈合情況并拍照。

1.4.6Transwell法檢測細(xì)胞遷移、侵襲 在Transwell下室膜上涂抹10 μL纖連蛋白，37 ℃培養(yǎng)4 h。胰酶消化細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液(每毫升4×105個(gè)，無血清)加至Transwell小室的上室中，下室加入600 μL含30%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃ 5%CO2孵育24 h后取出Transwell下室，用棉簽輕輕擦去膜上面未遷移的細(xì)胞，PBS浸洗，濾膜甲醇固定30 min，晾干后，0.1%結(jié)晶紫染液染色，拍照。進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，將上室用Matrigel預(yù)涂，其他步驟同遷移測定實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌、癌旁組織和細(xì)胞株中GKN2的表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果顯示，GKN2在癌旁組織中高表達(dá)，在胃癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)甚至缺失。同時(shí)利用Western blot、qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901、NCI-N87、MKN28、BGC-823、MKN45及正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1中GKN2蛋白及mRNA表達(dá)量。本組結(jié)果顯示，GKN2呈高表達(dá)，而胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901、NCI-N87、MKN28、BGC-823、MKN45中GKN2呈低表達(dá)或表達(dá)丟失，與GKN2在胃癌組織中的表達(dá)一致(圖2、3)。

2.2 GKN2過表達(dá)胃癌細(xì)胞株的構(gòu)建及驗(yàn)證選取AGS和SGC-7901作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，分別以LV-GKN2和空載質(zhì)粒LVCON238慢病毒感染細(xì)胞株構(gòu)建GKN2過表達(dá)組AGS-GKN2和SGC-7901-GKN2及對照組AGS-CON和SGC-7901-CON，篩選，熒光顯微鏡下觀察3周后，肉眼觀察熒光轉(zhuǎn)染率達(dá)90%以上，利用Western blot法和qRT-PCR檢測GKN2在各細(xì)胞株中的表達(dá)，驗(yàn)證了GKN2過表達(dá)組的表達(dá)量明顯增加，穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立(圖4、5)。

圖2 A.Western blot法檢測胃癌組織及正常胃黏膜組織中GKN2的表達(dá)量；B. Western blot法檢測正常胃黏膜細(xì)胞GES-1和各胃癌細(xì)胞株中GKN2的表達(dá)量：T.胃癌組織；N.正常胃黏膜組織

圖3 qRT-PCR檢測正常胃黏膜細(xì)胞和各胃癌細(xì)胞株中GKN2 mRNA的表達(dá)量

圖4 AGS穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立：A.qRT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株GKN2 mRNA的表達(dá)；B.Western blot法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株GKN2蛋白表達(dá)量，AGS-GKN2組比AGS-CON組GKN2明顯過表達(dá)；C.熒光顯微鏡下觀察AGS-CON、AGS-GKN2組熒光蛋白表達(dá)，慢病毒轉(zhuǎn)染成功率在90%以上

圖5 SGC-7901穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立：A.qRT-PCR檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株GKN2 mRNA表達(dá)量，SGC-7901-GKN2組比SGC-7901-CON組GKN2明顯過表達(dá)；B. Western blot法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株GKN2 蛋白表達(dá)量，SGC-7901-GKN2組比SGC-7901-CON組的GKN2明顯過表達(dá)；C.熒光顯微鏡下觀察SGC-7901-CON、SGC-7901-GKN2組熒光蛋白表達(dá)，慢病毒轉(zhuǎn)染成功率在90%以上

2.3 GKN2過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，采用RTCA系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測GKN2過表達(dá)組及對照組的細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，在AGS和SGC-7901細(xì)胞系中GKN2過表達(dá)顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖活性(P<0.05，圖6)。此外，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，與對照組相比，GKN2過表達(dá)后AGS和SGC-7901細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05，圖7)。

2.4 GKN2對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞穿過聚碳酸酯多孔濾膜的AGS-CON和AGS-GKN2細(xì)胞數(shù)量分別為501.33±45.59和187.33±31.23，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SGC-7901細(xì)胞穿過聚碳酸酯多孔濾膜的SGC-7901-CON和SGC-7901-GKN2細(xì)胞數(shù)量分別為587±28.80和85±12.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖8A)。

本實(shí)驗(yàn)在濾膜上室側(cè)鋪上基質(zhì)膠，細(xì)胞先分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)將基質(zhì)膠降解，才能通過濾膜進(jìn)入下室。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行48 h后在顯微鏡下拍照，進(jìn)入下室的細(xì)胞量多則可反映腫瘤細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng)。AGS細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的AGS-CON和AGS-GKN2細(xì)胞數(shù)量分別為83.67±21.89、39.00±12.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SGC-7901細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的AGS-CON和AGS-GKN2細(xì)胞數(shù)量分別為560±28.18，75.33±16.75，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖8B)。

圖6 RTCA系統(tǒng)顯示GKN2過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖活性的影響：A.AGS細(xì)胞株；B.SGC-7901細(xì)胞株

本組采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測GKN2對胃癌細(xì)胞創(chuàng)傷愈合能力的影響，結(jié)果顯示，48 h后GKN2過表達(dá)組的劃痕愈合距離明顯大于對照組(P<0.05，圖8C)，提示過表達(dá)GKN2明顯抑制胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

2.5 GKN2過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子水平的影響Western blot法檢測結(jié)果顯示，GKN2過表達(dá)明顯抑制胃癌細(xì)胞中增殖相關(guān)蛋白PCNA、Survivin、BCL-2的表達(dá)水平(P<0.05)。轉(zhuǎn)移相關(guān)分子研究結(jié)果顯示，GKN2過表達(dá)后，胃癌細(xì)胞中的Timp2表達(dá)水平升高，MMP-7和MMP-9表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖9)。

2.6 GKN2過表達(dá)對PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路激活水平的影響信號通路磷酸化水平反映通路被激活情況，磷酸化水平越高通路激活越明顯。PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路是一條公認(rèn)的與腫瘤相關(guān)的通路。胃癌細(xì)胞株中GKN2過表達(dá)可下調(diào)磷酸化PI3K、磷酸化AKT、mTOR的表達(dá)水平，上調(diào)PTEN表達(dá)水平(圖10)；提示GKN2可能通過抑制PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的激活水平，進(jìn)而發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

圖7 平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示GKN2過表達(dá)組的克隆形成數(shù)及克隆細(xì)胞群均少于對照組：A.AGS細(xì)胞株；B.SGC-7901細(xì)胞株

3 討論

GKN作為腫瘤抑制因子，在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，在動(dòng)態(tài)平衡和抑制胃腫瘤中發(fā)揮作用。GKN2作為GKN家族的重要成員，參與調(diào)控消化道上皮的增生從而維護(hù)黏膜的完整，在消化道上皮的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5-7]。

GKN2基因位于染色體2p13，含有5個(gè)外顯子可以編碼相對分子質(zhì)量為1.83×104的蛋白。GKN2是胃分泌的特異性蛋白，并帶有BRICHOS結(jié)構(gòu)域，其已被證實(shí)與腫瘤相關(guān)[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在

圖8 GKN2過表達(dá)對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的影響：A.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)示GKN2過表達(dá)組縱向遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組；B.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)示GKN2過表達(dá)組縱向侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于對照組；C.劃痕實(shí)驗(yàn)示GKN2過表達(dá)組橫向遷移能力明顯低于對照組正常人胃黏膜中GKN2呈高表達(dá)，但在HP感染直到胃部腫瘤形成的過程中GKN2表達(dá)下降，根除HP后GKN2表達(dá)明顯上調(diào)。GKN2是胃黏液層的組成之一，與TFF1在胃黏膜表面形成異源二聚體復(fù)合物，保護(hù)胃黏膜和促進(jìn)受損黏膜修復(fù)[5]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)GKN2在胃癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)明顯下調(diào)甚至缺失。上述結(jié)果表明，GKN2在維護(hù)胃黏膜的完整性和抑制腫瘤中起重要作用。

圖9 GKN2過表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖10 GKN2下調(diào)PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的激活水平

文獻(xiàn)報(bào)道GKN2在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)均下調(diào)或不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)將GKN2高表達(dá)病毒載體轉(zhuǎn)染到人胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901中，結(jié)果顯示，GKN2過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。目前已經(jīng)證實(shí)GKN1可以抑制胃癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲[8]，GKN2是否也有相同的作用呢？本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GKN2過表達(dá)對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有顯著阻滯作用，提示GKN2與GKN1一樣具有抑制胃癌細(xì)胞增值、遷移與侵襲作用。有研究表明，GKN2可能抑制超氧化物酶，導(dǎo)致活性氧水平升高和促進(jìn)活性氧誘導(dǎo)的線粒體膜電位受損引起胃癌細(xì)胞凋亡，且可通過與HSP70的結(jié)合抑制NF-κB和激活JNK信號通路，從而導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的增殖[9]。GKN2和TFF1形成的二聚體通過增強(qiáng)Caspase-3/Caspase-7的活性促進(jìn)細(xì)胞死亡[10]。GKN2通過下調(diào)GSK3β蛋白表達(dá)，下調(diào)Snail的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。根據(jù)以上研究結(jié)果，GKN2在胃癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是胃癌重要的抑制基因。

PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路是一條經(jīng)典的促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的通路，在胃癌中常常過度激活，在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[11]。PTEN是PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路的負(fù)調(diào)控分子，可催化PI3K脫磷酸化，當(dāng)其缺失時(shí)磷酸化的PI3K增加，PI3K/AKT/PTEN/mTOR通路進(jìn)一步激活。mTOR是細(xì)胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[12]，有研究表明，mTOR及其磷酸化形式在胃癌組織中過表達(dá)，其陽性率與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后明顯相關(guān)，是獨(dú)立的預(yù)后因子[13]。研究發(fā)現(xiàn)，GKN2過表達(dá)后可以下調(diào)磷酸化PI3K、磷酸化AKT、mTOR的表達(dá)，上調(diào)抑制因子PTEN的表達(dá)，抑制通路的過度激活。因此，本實(shí)驗(yàn)推測GKN2可能通過下調(diào)經(jīng)典通路PI3K/AKT/PTEN/mTOR的過度激活水平，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能。

綜上所述，GKN2在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能是具有潛力的腫瘤抑制基因，詮釋GKN2的作用機(jī)制將有助于進(jìn)一步闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌治療的分子靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。