姜黃素對前列腺癌細胞自噬的影響

劉 智，任 鵬，劉鳳煉，龍 金，陳志濤，石 磊，楊 喆，高曉勤

(1.貴州醫科大學第二附屬醫院，貴州 凱里 556000；2.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004)

前列腺癌是男性常見的惡性腫瘤，嚴重威脅男性身心健康。近年來前列腺癌的發病率和死亡率逐年升高[1-2]。迄今為止，關于前列腺癌的發病機制尚不完全清楚。大量文獻證實，前列腺癌發生常與DNA甲基化、雄激素受體基因異化、生長因子與表皮機制相互作用以及自噬等有關[3-5]。其中自噬被認為是與腫瘤發生發展的重要機制之一[6]。新近研究證實，Akt/mTOR信號通路作為調控自噬的經典通路參與前列腺癌的發生發展過程[7]。

姜黃素是一類從姜科草本植物郁金的根所提取得到的酚類物質，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤、抗炎、清除自由基、抗氧化等作用[8-9]。本研究旨在探討姜黃素誘導前列腺癌LNCaP細胞自噬的作用機制，為前列腺癌的治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 LNCaP細胞購自中科院細胞庫；姜黃素(純度98%，購自Sigama公司)；Akt、pAkt、mTOR、pmTOR抗體、LC3抗體、p62 抗體(購自Sigama公司)；MTT Assay試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(購自碧云天生物科技有限公司)。流式細胞儀(購自BD公司)；酶標儀(購自Bio-Teck)；PCR儀(購自美國Thermo公司)；垂直電泳儀(北京百晶生物)；培養瓶、培養板等(corning)；CO2細胞培養箱(NUAURE)。

1.2 細胞培養與處理 用含10%熱滅活的胎牛血清以及抗生素的DMEM培養基培養(37℃、5%CO2)，進入對數生長期后實驗。實驗分為對照組、姜黃素處理組(濃度為10、20、40 μmol/L)。作用24 h后實驗。

1.3 MTT檢測細胞增殖 MTT法分析細胞活性，將LNCaP細胞接種于培養板中的培養24 h后，不同濃度姜黃素處理24 h，棄上清，加入100 μl MTT溶液37℃繼續孵育2 h，再加入100 μl DMSO溶液，震蕩。并于570 nm波長處測定其吸光度，并計算細胞相對活性，計算公式：處理組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.4 流式細胞術 采用流式細胞術對細胞自噬進行量化分析。細胞接種于培養板24 h后，經不同濃度姜黃素處理24 h后。收集細胞，PBS洗滌兩次，用吖啶橙在4℃下染色15 min。用流式細胞儀FL1和FL3通道檢測細胞熒光強度。上述實驗重復三次。自噬率(%)=(FL3/FL1)×100。

1.5 RT-PCR實驗 LNCaP細胞培養經姜黃素(0、10、20、40 μmol/L)處理24 h后。用 Trizol試劑盒提取總RNA，逆轉錄成cDNA，PCR擴增。每個樣本總體積25 μl(包括染料12.5 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、ddH2O28 μl、cDNA 2.5 μl)反應條件為：90°C預變性l0 min，95°C變性10 s，60°C退火20 s，72℃延伸34 s，40個循環，β-actin為內參，檢測各模板的Ct值。以 2-ΔΔCt反映Beclin-1基因相對表達量。(Beclin-1上游引物：5’-AAA CCA GAT GCG TTA TGC CC-3’，下游引物：5’-GCG ACC CAG CCT GAA GTT AT-3’；β-actin上游引物：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游引物：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’)

1.6 Westernblot分析 收集約1×106個LNCaP細胞，加入裂解緩沖液冰上裂解30 min，然后蛋白定量。獲取50 μg蛋白在分離膠中進行電泳，結束后將其轉膜上，并用牛血清白蛋白封閉2 h。加入相應一抗以及二抗，進行化學發光、顯影。

2 結果

2.1 姜黃素對LNCaP細胞增殖的影響 為了評價不同濃度姜黃素對LNCaP細胞增殖的影響，本研究首先采用姜黃素(0、10、20、40 mol/L)孵育LNCaP細胞24 h，之后采用MTT法檢測細胞活力。結果顯示，隨著姜黃素劑量增加，對LNCaP細胞生長的抑制作用越顯著，并呈劑量依賴(見圖1)。流式細胞術檢測LNCaP細胞自噬情況，結果顯示，姜黃素呈劑量依賴地誘導LNCaP細胞的自噬反應(見圖2)，這提示姜黃素誘導LNCaP細胞的自噬。

圖1 姜黃素對LNCaP細胞增殖抑制率的影響

圖2 姜黃素對LNCaP細胞自噬率的影響

2.2 姜黃素對LNCaP細胞自噬的影響 采用姜黃素(0、10、20、40 mol/L)孵育LNCaP細胞24 h后，采用western blot和RT-PCR分別檢測了Beclin-1蛋白和mRNA表達的情況，結果顯示，姜黃素(0、10、20、40 mol/L)劑量依賴地引起細胞自噬增加(見圖3)。

圖3 姜黃素對Beclin-1蛋白和mRNA表達的影響

2.3 姜黃素誘導LNCaP細胞自噬對Akt/mTOR信號通路相關蛋白的影響 采用western blotting檢測了自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I、p62的表達情況，結果顯示，與對照組比較，姜黃素引起LC3II/LC3I比值升高，p62蛋白表達水平下降，且呈劑量依賴性(見圖4)這些結果提示姜黃素誘導LNCaP細胞自噬。檢測自噬Akt/mTOR信號通路參與調控相關蛋白p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的表達水平，結果發現，與對照組比較，姜黃素促進p-Akt，p-mTOR磷酸化水平下降，并呈濃度依賴(見圖5)，提示Akt/mTOR通路參與姜黃素誘導LNCaP細胞自噬抑制細胞增殖。

圖4 姜黃素對LCII/LCI、p62蛋白表達情況的影響

圖5 姜黃素對p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR相關蛋白表達情況的影響

3 討論

細胞自噬是目前腫瘤領域研究熱點之一，自噬與腫瘤關系密切，對腫瘤發生、發展起著重要作用[6]。姜黃素是一種植物提取物，近年來姜黃素等天然化合物已成為腫瘤治療中預防和治療策略的研究熱點。研究證實，姜黃素能阻斷DAMPs-TLR4信號通路途徑抑制黑色素瘤細胞的增殖及轉移[10]。姜黃素還能顯著降低胃癌的存活率和增殖能力，誘導細胞凋亡[11]。這些研究提示姜黃素也可能具有抑制前列腺癌細胞增殖和誘導自噬的作用，

姜黃素是植物姜黃中根莖中最具生物活性的多酚異黃酮，其顯著的特點是具有抗炎和抗腫瘤特性[12-13]。大量文獻已證實姜黃素對腫瘤發生發展具有化學預防作用[14]。其依據是，姜黃素多種動物腫瘤模型上表現出對致癌作用的多效性抑制作用，尤其在前列腺癌動物模型上。其涉及的關鍵機制可能包括：(1)小干擾RNA下調DNA結合1抑制劑的表達；(2)腫瘤抑制因子p53的修復；(3)Nrf2信號的激活[15]；(4)下調VEGF表達[16]；(5)調節toll樣受體(TLR)/interleukin-1受體(IL-1R)途徑；(6)轉化生長因子beta1(TGF-β1)；(7)調節炎癥介質，例如誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環氧合酶2(COX2)；(8)通過下調Bcl-2并上調Bax促進細胞凋亡[17]；(9)抑制MMP9[16]。此外還有研究報道，姜黃素可通過調節前列腺癌細胞炎癥相關通路、MAPK、JAK/STAT信號抑制前列腺癌細胞的增殖。新近研究發現，姜黃素可通過調節前列腺癌細胞自噬促進腫瘤細胞的凋亡[15]。Beclin1作為自噬的特異性標志物，與自噬過程密切相關，尤其在自噬的早期。LC3I向LC3II的轉化有助于自噬體的形成，LC3II常被認為是一種自噬體標記物。本研究為了證實姜黃素對前列腺癌LNCaP細胞系的影響，首先檢測了姜黃素對細胞活力和細胞自噬率，發現姜黃素抑制LNCaP細胞增殖，并發現這種抑制作用隨著劑量的增加而增強，同時伴隨細胞自噬的增強。

Akt/mTOR通路是研究調控細胞自噬的經典通路，特別是參與了腫瘤發生發展[7]。為了證實細胞自噬Akt/mTOR信號是否參與姜黃素對LNCaP細胞的影響，研究檢測了自噬相關蛋白Beclin-1，LC3II,，LC3I，p62，p-Akt，Akt，p-mTOR和mTOR的表達情況，發現自噬相關蛋白Beclin-1，LC3II，LC3I表達上調，p62表達下調，p-Akt和p-mTOR磷酸化水平下降，這些結果提示姜黃素可能通過Akt/mTOR通路誘導LNCaP細胞自噬，這與姜黃素抑制其他類型腫瘤細胞自噬途徑的文獻報道一致。

綜上所述，姜黃素通過抑制Akt/mTOR分子信號通路誘導LNCaP細胞自噬抑制細胞增殖，提示姜黃素是一種潛在的前列腺癌治療的候選藥物。