沉默ELAVL1基因表達體外和體內抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖

周逢海，呂海迪，周 川，張曉峰，張 發

胚胎致死性異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族成員中的人抗原R（human antigen R，HuR）即為ELAVL1蛋白，其是一種RNA結合蛋白，在正常細胞中主要分布于細胞核中，當其從細胞核轉移至細胞質中時即能夠與mRNA結合促進目的蛋白的表達[1]。HuR廣泛表達于包括小腸、脾臟和卵巢等組織中，通過轉錄后機制參與細胞中許多分子的調控表達[2]。然而，其他家族成員HuB、HuC和HuD幾乎只表達在神經組織中，參與相關分子的表達調控[2]。

研究表明，ELAVL1基因與腫瘤的多種生物學行為有關；與癌旁組織或正常組織相比，ELAVL1在結直腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤組織中高表達，且主要表達于細胞質中[2-7]。ELAVL1通過與腫瘤生物學功能有關的多種分子的mRNA相結合從而促進蛋白表達，進而影響腫瘤細胞多種生物學功能包括細胞增殖、周期、凋亡和侵襲等，甚至還與腫瘤細胞的放化療耐受相關，最終導致腫瘤的發生和進展[2-7]。然而，當前有關ELAVL1在前列腺癌中的表達及作用鮮有報道。已有的研究同樣發現，與正常前列腺組織相比，ELAVL1在前列腺癌組織中高表達且主要表達于細胞質中[8]，初步研究表明高表達的ELAVL1與前列腺癌的發生和發展密切相關，但機制如何仍缺乏深入的研究。

本研究中將攜帶有特異性針對ELAVL1基因的ELAVL1-shRNA（shELAVL1）重組腺病毒載體導入前列腺癌PC-3細胞內從而實現ELAVL1 mRNA和蛋白的特異性沉默，并在此基礎上通過檢測細胞增殖能力及細胞周期，從而觀察ELAVL1對PC-3細胞生長的作用；之后通過檢測與上述生物學作用相關的蛋白分子及腫瘤經典信號通路磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）中的蛋白分子實現初步的機制探究；最后利用PC-3細胞構建裸鼠移植瘤模型，并給予瘤內注射攜帶有ELAVL1-shRNA的重組腺病毒，觀察沉默ELAVL1基因表達對移植瘤生長的影響，進一步通過體內研究證實ELAVL1對前列腺癌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗動物

正常前列腺上皮細胞RWPE-1和前列腺癌PC-3細胞均購于中國科學院細胞庫/干細胞庫。BALB/c-nu裸鼠、4～5周齡、雄性、體質量為15～18 g購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002）]。

1.2 試劑和儀器

攜帶有特異性針對ELAVL1基因的shRNA（shELAVL1）的復制缺陷型重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP和對照空載體病毒Ad5-GFP由本課題組前期構建獲得[9]。RPMI 1640細胞培養液和青霉素鏈霉素雙抗購自美國HyClone公司，RWPE-1細胞專用培養液PEpiCM購自美國ScienCell研究實驗室，胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。兔抗人ELAVL1單克隆抗體、兔抗人環氧合酶2（cyclooxygenase-2，Cox-2）多克隆抗體、兔抗人細胞周期蛋白D1（cyclin D1）多克隆抗體、兔抗人AKT單克隆抗體，兔抗人磷酸化-AKT（phospho-AKT，p-AKt）多克隆抗體和兔抗人PI3K多克隆抗體購自英國Abcam公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TEMED、電化學發光試劑、30%丙烯酰胺、10% SDS溶液和Triton X-100等均購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜購自美國Merck Millipore公司；Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG購自美國Invitrogen公司；DAPI細胞染色液購于國藥集團化學試劑有限公司。CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）和RNaseA購自美國Sigma公司。反轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒均購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。

凝膠成像分析系統（型號：ChemiDoc-It2）為美國UVP公司產品，倒置光學顯微鏡（型號：CKX31）為日本Olympus公司產品，流式細胞儀（FACSVerse）為美國BD公司產品，酶聯免疫檢測儀（型號：Infinite 200）為瑞士TECAN公司產品,熒光顯微鏡（型號：MF43）為美國Advanced Microscopy公司產品。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測PC-3細胞和RWPE-1細胞中ELAVL1 mRNA的表達水平

收集前列腺癌PC-3和前列腺正常上皮細胞RWPE-1，用TRIzol試劑提取細胞的總RNA并反轉為cDNA。反轉錄條件：按5×Reverse Transcription Buffer 2 μL、OligdT引物1 μL、RNA 1 μg和MMLV RTase 0.5 μL的比例配制反應液，用DEPC處理后的ddH2O補充至10 μL；反應條件為37 ℃ 20 min，95 ℃ 5min。反轉錄完成后，以此cDNA為模板，按照2×Realtime PCR Master Mix 5 μL、2條引物各0.4 μL、cDNA 0.1 μL、加ddH2O補充至10 μL的比例配制PCR反應體系；擴增條件為95 ℃ 3 min；94℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個循環；95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s。引物序列見表1。反應結束后，用PCR軟件生成擴增曲線和溶解曲線，定量PCR并對實驗數據進行統計分析。

1.4 蛋白質印跡法檢PC-3及RWPE-1細胞中ELAVL1蛋白的表達水平

將PC-3及RWPE-1細胞接種于6孔板培養板中，待細胞融合度為80%～90%時，收集細胞并提取細胞總蛋白；行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白條帶電轉移至硝酸纖維素膜上；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理2 h，加入一抗[兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（內參照）（體積稀釋比例為1∶1 000）]室溫孵育2 h；TBST洗膜（8 min/次×3次），隨后加入二抗[辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）或辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）]均室溫孵育1 h；TBST洗膜（8 min/次×3次），滴加電化學發光液后于發光成像儀中顯影。

1.5 免疫組織化學法檢測PC-3及RWPE-1細胞中ELAVL1蛋白的表達水平并定位

將PC-3和RWPE-1細胞接種于直徑為3.5 cm的培養皿中蓋玻片進行細胞爬片，細胞生長至融合度為70%時，去除細胞培養液，用PBS清洗細胞（3 min/次×3次）；滴入4%多聚甲醛溶液室溫下固定10 min，PBS清洗（3 min/次×3次）；用3%雙氧水室溫下進行孵育10 min；加入含1%胎牛血清白蛋白非特異性抗原（150 μL）封閉處理10～15 min；滴加一抗[兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶100）]50 μL，4 ℃下濕盒孵育過夜。PBS清洗3遍后滴加二抗，室溫條件下孵育1 h。PBS清洗（4 min/次×2次）后DAB顯色。常規處理后，中性樹脂進行封片，放于顯微鏡下進行蛋白定位觀察。

1.6 免疫熒光法檢測PC-3和RWPE-1細胞中ELAVL1蛋白的定位

將PC-3和RWPE-1細胞接種于直徑為3.5 cm的培養皿中蓋玻片進行細胞爬片，細胞生長至融合度為70%時，去除細胞培養液，隨后用PBS清洗細胞（3 min/次×3次），加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min，用PBS清洗細胞（3 min/次×3次）；加入0.5% TritonX-100適量保證覆蓋載玻片持續5 min，進行細胞膜通透。用PBS清洗細胞（3 min/次×3次），加入封閉液1～2 mL處理1.5 h進行非特異性抗原封閉。向培養皿中加入一抗[兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶100）]1 mL，常溫下反應2 h。BS清洗細胞（3 min/次×4次），加入用PBS稀釋后的二抗（Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG）1 mL，避光常溫下反應2 h。PBS清洗后加入DAPI染色液染細胞核，靜置3 min后，在載玻片上滴加甘油并用蓋玻片進行封片，置于熒光顯微鏡下觀察ELAVL1蛋白的定位情況。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequence of real-time fluorescent quantitative PCR

1.7 蛋白印跡檢測感染重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP后PC-3細胞中ELAVL1蛋白的沉默效率

將PC-3細胞接種于6孔板培養板中，1 d后待其融合度為60%～70%時，將重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP及空載體腺病毒Ad5-GFP，按照感染復數（multiplicity of infection，MOI）＝300感染PC-3細胞（以未用任何藥物處理的PC-3細胞作為空白對照組）；8 h后更換為新鮮完全培養液繼續置于37 ℃，CO2體積分數為5%的培養箱中繼續培養72 h，隨后收集各組細胞并提取總蛋白。采用蛋白質印跡法檢測ELAVL1蛋白的表達水平，實驗流程同1.4節。

1.8 CCK-8檢測沉默ELAVL1表達對PC-3細胞增殖能力的影響

用胰蛋白酶消化PC-3細胞后收集細胞，用培養液重懸細胞后計數并調整PC-3細胞密度為1×105個/mL，隨后在96孔板接種100 μL/孔細胞（1×104個細胞），第2天待細胞融合度在50%～70%時按照MOI＝300對每孔分別進行病毒感染。實驗分組同1.6節，分為空白對照組、Ad5-shELAVL1-GFP組和對照空載體腺病毒Ad5-GFP組，每組設置4個復孔；病毒感染8 h后更換為新鮮的完全培養液，分別于第0、24、36、48和72 h時取所需檢測的樣品測孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于CO2培養箱中繼續孵育2 h，最后在酶標免疫檢測儀波長450 nm處檢測各孔的D值，并以時間-D值繪制生長曲線。

1.9 FCM法檢測沉默ELAVL1表達對PC-3細胞周期的影響

細胞的分組及處理同1.7節，病毒感染后第5天用胰蛋白酶消化細胞并收集于離心管（10 mL）中，離心除去上清液，加入4 ℃預冷的PBS洗滌后，加入預冷的75%乙醇溶液固定細胞（置于－20 ℃冰箱過夜）。取出細胞再用4 ℃預冷的PBS洗滌（5 min/次×2次）。將濃度為200 μg/mL的RNA酶0.2 mL加入其中，并在避光37 ℃條件下孵育30 min，之后加入PI（100 μg/mL）0.2 mL染色，室溫條件下避光進行孵育30 min，之后上流式細胞儀進行周期的檢測。

1.10 蛋白質印跡法檢測沉默ELAVL1表達對PC-3細胞中Cox-2、Cyclin D1、PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達水平的影響

細胞的分組及處理同1.7節，病毒感染8 h后更換為新鮮的完全培養液，繼續置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱進行培養。72 h后收集各組細胞并提取總蛋白，采用蛋白質印跡法檢測Cox-2、Cyclin D1、PI3K、AKT及p-AKT蛋白的表達水平，檢測流程同1.4節。一抗分別兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）、兔抗人Cox-2多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）、兔抗人cyclin D1多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）、兔抗人PI3K多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶300）、兔抗人AKT單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200）、兔抗人p-AKT多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200），鼠抗人β-actin單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 000），二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（體積稀釋比例均為1∶1 000）。

1.11 前列腺癌PC-3細胞皮下移植瘤模型建立

裸鼠購買后于無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級環境中適應飼養3 d。將PC-3細胞接種于培養皿中，待細胞融合度為70%時收集細胞并調整細胞密度為1×107個/mL。取100 μL（細胞數約為1×106個）細胞懸液采用注射的方法接種于裸鼠左側腹部皮下。2周后，以裸鼠左側腹部出現直徑＞5 mm的移植瘤提示裸鼠移植瘤構建成功。

1.12 Ad5-shELAVL1-GFP抑制前列腺癌PC-3細胞皮下移植瘤的生長

PC-3細胞接種2周后，采用隨機數字表法將移植瘤構建成功的裸鼠共27只隨機分為3組，每組9只，采用瘤內注射的方式分別給予0.9%氯化鈉溶液、重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP及空載體腺病毒Ad5-GFP治療；每只裸鼠每次瘤內注射腺病毒（病毒滴度為2×1011pfu/mL）50 μL，每周2次，連續2周。0.9%氯化鈉溶液作為空白對照組同樣按照上述給藥方式和劑量給藥。

首次給藥后每3 d一次記錄裸鼠移植瘤的長（a）短（b）徑，計算腫瘤體積并繪制腫瘤體積增長曲線，腫瘤體積＝1/2×a×b2。18 d后處死所有小鼠取出移植瘤稱重。

1.13 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件對所有的實驗數據進行統計學分析，計量資料采用表示。組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義

2 結果

2.1 ELAVL1 mRNA和蛋白在前列腺癌中的表達情況

實時熒光定量PCR法檢測結果（圖1A）顯示，正常前列腺正常上皮RWPE-1細胞和前列腺癌PC-3細胞中ELAVL1 mRNA的相對表達量分別為1.0±0.04和2.11±0.02，PC-3細胞中ELAVL1 mRNA的表達水平較RWPE-1細胞明顯上調（P＜0.001）。

蛋白質印跡法檢測結果（圖1B）同樣顯示，PC-3細胞中的ELAVL1蛋白的表達水平明顯高于RWPE-1細胞，差異具有明顯的統計學意義（P＜0.001）。

Fig.1 The expression levels of embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) mRNA and protein in normal prostate epithelial cells RWPE-1 and prostate cancer PC-3 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (A) and Western blotting (B),respectively.***P＜0.001,vs RWPE-1 cells (n=3).圖1 分別采用實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法檢測ELAVL1 mRNA（A）及蛋白（B）在前列腺正常上皮RWPE-1細胞和前列腺癌PC-3細胞中的表達水平

上述結果說明，ELAVL1在前列腺癌細胞中的表達水平明顯提高。

2.2 ELAVL1蛋白在前列腺癌細胞中的表達定位

免疫組織化學檢測結果（圖2A）顯示，RWPE-1細胞核中ELAVL1蛋白染色較深，細胞質中染色較淺并且無ELAVL1蛋白染色顆粒，提示ELAVL1蛋白主要集中表達于細胞核中；而在PC-3細胞中，細胞核中該蛋白染色較淺，細胞質中出現明顯的蛋白染色顆粒提示ELAVL1蛋白主要在細胞質中表達。

免疫熒光法檢測結果（圖2B）顯示，正常前列腺上皮RWPE-1細胞中ELAVL1蛋白的紅色熒光在細胞核和細胞質中均出現，融合后的圖片顯示RWPE-1細胞核呈現紫色，細胞質紅色熒光較淺，說明ELAVL1蛋白主要表達在細胞核中，細胞質中較少。而在前列腺癌PC-3細胞中，紅色熒光主要富集在細胞質中，融合后圖片顯示細胞核仍為藍色，細胞質紅色熒光較亮，說明ELAVL1蛋白主要表達在細胞質中。

Fig.2 The localization of embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) protein in normal prostate epithelial cells RWPE-1 and prostate cancer PC-3 cells were detected by immunohistochemical method (A,DAB,×400) and immunofluorescence (B,×400),respectively.圖2 分別采用免疫組織化學法（A，DAB，×400）和免疫熒光法（B，×400）檢測ELAVL1蛋白在正常前列腺上皮RWPE-1細胞和前列腺癌PC-3細胞中的定位情況

2.3 沉默ELAVL1基因表達對前列腺癌PC-3細胞增殖能力的影響

PC-3細胞感染重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP后，蛋白質印跡法檢測結果（圖3A）顯示，與對照組相比，Ad5-shELAVL1-GFP組中ELAVL1蛋白的表達水平明顯下調（P＜0.05）。這一結果提示，PC-3細胞中ELAVL1基因被有效的沉默。

CCK-8法檢測結果（圖3B）顯示，Ad5-shELAVL1-GFP組PC-3細胞的D值在0、24和36 h分別與Ad5-GFP組和空白對照組相比，差異均無統計學意義（P值均＞0.05）；而在48和72 h時Ad5-shELAVL1-GFP組細胞的D值較Ad5-GFP組明顯降低，差異有統計學意義（P值均＜0.05）。Ad5-GFP組和空白對照組在0、24、36、48和72 h的D值差異無統計學意義（P值均＞0.05）。以上結果說明，對照重組腺病毒空體載Ad5-GFP對PC-3細胞的增殖能力無明顯的影響，而在ELAVL1-shRNA沉默ELAVL1基因表達后0、24和36 h時抑制細胞增殖能力的作用不顯著，在48和72 h時其抑制細胞增殖能力的作用明顯提高。

2.4 沉默ELAVL1基因對前列腺癌PC-3細胞周期的影響

FCM法檢測結果（圖4）顯示，腺病毒空載體Ad5-GFP組PC-3細胞中G1期細胞所占的比例為（73.67%±1.41）%，明顯高于Ad5-shELAVL1-GFP組的（50.02±1.73）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而腺病毒空載體Ad5-GFP組中G2期細胞所占的比例為（6.19±0.35）%，明顯低于Ad5-shELAVL1-GFP組的（26.92±1.83）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）；腺病毒空載體Ad5-GFP組中G1期細胞和G2期細胞所占的比例與空白對照組相比，差異均無統計學意義（P值均＞0.05）。

以上結果說明沉默ELAVL1基因能夠使得前列腺癌PC-3細胞周期被阻滯于G1期。

2.5 沉默ELAVL1基因表達對前列腺癌PC-3細胞中Cox-2、cyclin D1、PI3K、AKT和p-AKT等蛋白表達水平的影響

蛋白質印跡法檢測了各組PC-3細胞中ELAVL1、AKT、cyclin D1、p-AKT、Cox-2和PI3K蛋白的相對表達水平。結果（圖5）顯示，與對照組空載體腺病毒Ad5-GFP組相比，重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP組PC-3細胞中與細胞周期及增殖相關蛋白cyclin D1和Cox-2及與PI3K/AKT信號通路相關的蛋白AKT、p-AKT和PI3K的表達水平均明顯下調，差異有統計學意義（P值均＜0.05）。這一結果說明，沉默ELAVL1基因表達后，AKT、PI3K、p-AKT、cyclin D1及Cox-2等蛋白的表達水平隨之下降，表明在腫瘤細胞PC-3中ELAVL1可能參與了調控細胞的增殖及周期，并涉及到PI3K/AKT信號通路。

Fig.3 The expression level of embryonic lethal abnormal vision-like 1 (ELAVL1) protein in prostate cancer PC-3 cells infected with recombinant adenovirus Ad5-shELAVL1-GFP was detected by Western blotting (A),the effect of silencing ELAVL1 gene on proliferation of PC-3 cells was detected by CCK-8 method (B).PC-3 cells were infected with adenovirus empty vector Ad5-GFP as the control;PC-3 cells were treated without any drugs as the blank control.*P＜0.05,vs Ad5-GFP group (n=3).圖3 采用蛋白質印跡法檢測PC-3細胞中ELAVL1蛋白的沉默效果（A）及CCK-8法檢測沉默ELAVL1基因表達對PC-3細胞增殖的影響（B）

Fig.4 The effect of silencing embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) gene in PC-3 cells on cell cycle distribution was detected by FCM assay.PC-3 cells were treated without any drugs as the blank control,PC-3 cells were infected with adenovirus empty vector Ad5-GFP as the control.*P＜0.05 (n=3).圖4 沉默ELAVL1基因表達對PC-3細胞周期的影響

Fig.5 The effect of silencing embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) gene in PC-3 cells on the protein expressions of protein kinase B (PKB,also known as AKT),cyclin D1,phospho-AKT (p-Akt),cyclooxygenase-2 (Cox-2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) were detected by Western blotting.PC-3 cells were treated without any drugs as the blank control,PC-3 cells were infected with adenovirus empty vector Ad5-GFP as the control.*P＜0.05,vs Ad5-GFP group (n=3).圖5 蛋白質印跡法檢測沉默ELAVL1基因表達對PC-3細胞中AKT、cyclin D1、p-AKT、Cox-2和PI3K蛋白表達的影響

2.6 重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP對前列腺癌PC-3細胞移植瘤的作用

Fig.6 The effect of intratumoral injection of recombinant adenoviral vector Ad5-shELAVL1-GFP on the growth of prostate cancer PC-3 cells xenografts in nude mice.A:Xenograft tumors on the 14th day after subcutaneous injection of PC-3 cells in the left abdomen of nude mice;B:Comparison of growth curves of xenograft tumors of PC-3 cells in nude mice.Xenograft tumors that were treated with 0.9% sodium chloride solution.C:On day 33,observation of xenograft tumors in nude mice treated with Ad5-shELAVL1-GFP,treated with 0.9% sodium chloride solution as the blank control,and treated with Ad5-GFP as the control.D:Comparison of the weight of xenograft tumors obtained from nude mice,treated with Ad5-shELAVL1-GFP,treated with 0.9% sodium chloride solution as the blank control,and treated with Ad5-GFP as the control.*P＜0.05,vs Ad5-GFP (n=9).圖6 瘤內注射重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP對裸鼠前列腺癌PC-3細胞移植瘤生長的影響

將PC-3細胞接種于裸鼠左側腹部皮下，14 d后在接種處出現圓形飽滿的移植瘤（圖6A），次日開始將重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP、對照空載體腺病毒Ad5-GFP及0.9%氯化鈉溶液（空白對照組）進行瘤內注射。在瘤內注射病毒期間，小鼠飲食、活動能力、毛色和精神狀況均良好，移植瘤生長曲線結果顯示（圖6B），Ad5-shELAVL1-GFP組的裸鼠腫瘤生長速度與對照組相比明顯減緩（P＜0.05），而對照病毒組與空白對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。第33天時對裸鼠荷瘤體積大體觀察（圖6C）可見，Ad5-shELAVL1-GFP組裸鼠的移植瘤較對照病毒組和空白對照組明顯縮小。對3組移植瘤標本的稱重結果（圖6D）顯示，Ad5-shELAVL1-GFP組、對照病毒組和空白對照組移植瘤的質量分別為（0.24±0.15）g、（0.67±0.21）g和（0.79±0.34）g，Ad5-shELAVL1-GFP組與對照病毒組和空白對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05），而對照組和空白對照組間則差異無統計學意義（P＞0.05）。

上述結果說明，沉默ELAVL1基因表達能夠減緩前列腺癌腫瘤的生長。

3 討論

已有的研究表明，前列腺癌組織中ELAVL1的表達水平明顯高于正常前列腺組織[8]。本研究中發現，前列腺癌PC-3細胞中ELAVL1蛋白的表達水平明顯高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1，該結果符合前述前列腺癌臨床樣本的研究結果。另外以往研究中也已證實，在其他腫瘤中包括肝癌、乳腺癌和肺癌等，ELAVL1蛋白的表達水平高于正常組織[5,10-11]，本研究結果符合ELAVL1在其他腫瘤中的表達情況。此外，本研究中發現ELAVL1在前列腺癌PC-3細胞中主要集中表達于細胞質中，而在RWPE-1中主要表達于細胞核上。ELAVL1蛋白在細胞核和細胞質中均有表達，正常情況其主要位于細胞核中，在受到刺激后ELAVL1蛋白與目的mRNA結合穿梭至細胞質中進行調控，之后mRNA被釋放，ELAVL1返回細胞核[2]。因此，細胞質中的ELAVL1才能真正發揮調控生物學的作用。多項研究發現，腫瘤細胞中高表達的ELAVL1主要集中于細胞質，且這些細胞質中的ELAVL1具有顯著促腫瘤作用[12-15]，由此可見細胞質中ELAVL1的堆積是其促腫瘤作用的關鍵。本研究中發現，與RWPE-1細胞相比，高表達的ELAVL1在PC-3細胞中主要位于細胞質中，初步推測與其他腫瘤一樣，ELAVL1對于前列腺癌發生和發展同樣具有促進作用。

腫瘤的生長依賴于細胞積極的分裂，已有的研究報告顯示ELAVL1基因與細胞周期相關蛋白包括cyclin D1、cyclin E1和cyclin A2等[16-18]，沉默ELAVL1基因表達后這些周期相關蛋白的表達均呈下降趨勢。如YUAN等[19]在乳腺癌中的研究發現ELAVL1基因被敲減后，腫瘤細胞的生長緩慢，cyclin D1的表達水平也呈下調趨勢。MURALIDHARAN等[20]在肺癌中的研究結果也同樣顯示，利用siRNA干擾技術沉默ELAVL1基因表達后，肺癌細胞的增殖能力被明顯抑制，cyclin D1和cyclin E的表達水平明顯減低。在前列腺癌的有關研究中，已經有學者證實了Cox-2表達也與腫瘤的進展和預后差有關[21]。有關ELAVL1蛋白和Cox-2之間關系，有研究發現沉默ELAVL1基因表達可以引起Cox-2的表達下調[8]。本研究中同樣發現，沉默ELAVL1基因表達后PC-3細胞的生長被抑制，且細胞周期被阻滯于G1期；與細胞增殖有關的分子cyclin D1和Cox-2蛋白的表達水平下降。體內裸鼠PC-3細胞移植瘤模型實驗進一步證實了，敲低ELAVL1基因表達后能夠抑制腫瘤的生長。上述研究結果充分說明，前列腺癌中高表達的ELAVL1可能是通過細胞周期促進前列腺癌的發展。

腫瘤發生和發展的信號通路有很多，包括Janus激酶（janus kinase，JAK）/信號轉導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路、PI3K/AKT信號通路以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activate protein kinase，MAPK）通路等[22]，盡管目前許多研究證明了ELAVL1基因與多種腫瘤生物活動相關的生物分子有關，但是目前有關詳細ELAVL1蛋白信號通路的研究報道不多，有學者在神經膠質瘤研究中認為ELAVL1通過PKM2/ELAVL1/p27信號通路來促進腫瘤的發生和發展[23]，也有學者在血液腫瘤研究中發現ELAVL1影響鼠雙微體基因2（murine doubleminute 2，MDM2）-p53信號通路[24]。本研究中發現，沉默ELAVL1基因表達可導致PI3K/AKT信號通路中的PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達水平下調，提示ELAVL1蛋白通過影響PI3K/AKT信號通路促進腫瘤的發生和發展。然而，本研究未進一步探究PI3K/AKT信號通路的抑制是cyclin D1和Cox-2的表達下調的上游機制，但根據文獻報道在腫瘤PI3K/AKT信號通路中，其下游調控的分子包含cyclin D1和Cox-2[25-26]，因此推測ELAVL1蛋白可能通過PI3K/AKT信號通路進而調控cyclin D1和Cox-2表達從而影響PC-3細胞的生長。