Linc00355在結腸癌中表達上調并促進腫瘤細胞增殖和侵襲

李玖明，崔凱颯，王 雪，黃朝暉

結腸癌作為臨床常見的一種惡性腫瘤，近年來發病率和死亡率均呈現逐年升高的趨勢[1]。結腸癌的發病機制復雜，涉及遺傳學、表觀遺傳學以及腫瘤微環境等多個因素的調控。在生物體中，通?？筛鶕涫欠窬邆涞鞍拙幋a功能將RNA分為編碼RNA及非編碼RNA。近年研究已證實，非編碼RNA并非是基因轉錄的“噪音”，而是具有重要的生物學功能[2]。其中長度＞200 bp的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）廣泛存在于細胞核和細胞質中。LncRNA可通過多種機制調控生理、病理過程，不僅影響細胞生長、分化、遷移和凋亡等功能，還在疾病的診斷和治療中具有重要的應用價值。

有研究發現，Linc00355在胃癌中表達上調，并通過調節Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）通路促進細胞增殖[3]。在頭頸部鱗狀細胞癌中高表達的Linc00355可通過調控微RNA（microRNA，miR）-195/HOXA10信號軸促進細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化[4]。但Linc00355在結腸癌中的功能和機制目前尚不清楚。

本研究基于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等數據庫結腸癌轉錄組數據，發現Linc00355在腫瘤中表達顯著上調，并可能是一個結腸癌潛在的新預后指標。通過生物信息學方法預測與Linc00355相關的靶基因，進行基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析，預測Linc00355在結腸癌中的功能以及分子調控機制，并通過細胞實驗初步探討Linc00355對結腸癌細胞生物學功能的影響，以期為結腸癌的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

結腸癌細胞株HCT116購自美國菌種保藏中心。DMEM購自美國HyClone公司，胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購自中國碧云天生物技術公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國Gibco公司，LipofectAMINE 2000購自美國Invitrogen公司。CCK-8購自日本Dojindo公司，RNAiso和PrimeScript反轉錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技公司，Transwell小室購自美國Corning公司。Linc00355小干擾及陰性對照購自中國吉瑪基因公司。

實時熒光定量PCR儀器（型號：SLAN-96P）為上海宏石醫療科技有限公司產品，光學顯微鏡（型號：EVOS M7000）為美國賽默飛公司產品，全自動酶標儀（型號：Bio-Tek ELX800）為美國寶特公司產品。

1.2 生物信息學分析

首先從TCGA數據庫中下載473例結腸癌患者（包括473例癌組織及41例配對的癌旁正常組織）測序數據及患者臨床資料。首先將下載的數據整理成基因表達矩陣文件，利用R語言EdgeR包對樣本分別進行LncRNA在腫瘤中的差異分析，選取差異表達P＜0.05且|Log2Fold Change，Log2FC|＞2的基因作為差異表達LncRNA用于后續分析。利用基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）芯片數據庫（GSE23878、GSE41328和GSE39582）中Linc00355的表達數據繪制差異表達圖，并根據臨床信息進行Kaplan-Meier生存分析并繪制生存曲線。進一步采用共表達方法預測Linc00355的靶基因。利用R語言Limma包對表達矩陣分析，篩選與Linc00355表達具有相關性的mRNA（P＜0.05，相關系數R＞0.3）。利用GEO芯片數據庫（GSE38832）中Linc00355、黑色素瘤抗原A3（melanoma antigen-A3，MAGE-A3）和周期蛋白依賴性激酶抑制因子CDKN1A的表達數據繪制相關性散點圖（P＜0.05，相關系數R＞0.3）。最后使用DAVID數據庫，對54個與Linc00355相關的mRNA進行GO功能富集分析。使用R語言Ggplot2包進行可視化作圖。

1.3 細胞培養及轉染

HCT116細胞使用含10% FBS、100 mg/L青霉素/鏈霉素的DMEM培養液，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中進行培養。待細胞貼壁且占滿培養皿底面積的80%～90%時傳代。HCT116細胞用胰蛋白酶消化傳代后，按3×105個/孔的密度接種于6孔板中。根據LipofectAMINE 2000轉染試劑說明書分別將陰性對照siRNA（siNC）和2條針對Linc00355的siRNA（siLinc00355-1和siLinc00355-2）轉入HCT116細胞中。siNC正義鏈序列為5’-UUCUUCGAAGGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；siLinc00355-1正義鏈序列為5’-CCACUGACAGCAGAGUCUUTT-3’，反義鏈序列為5’-AAGACUGCUGUCAGUGGTT-3’；siLinc00355-2正義鏈序列為5’-GGGAAACUCUCUACGCUAUTT-3’，反義鏈序列為5’-AUAGCGUAGAGAGUUUCCCTT-3’。

1.4 實時熒光定量PCR

收集HCT116細胞（5×106個），用PBS清洗3遍，采用RNAiso試劑盒提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA后，進行實時熒光定量PCR檢測，以β-actin基因作為內參照；PCR擴增反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃ 30 s、95 ℃5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環。以2－ΔΔCt值表述目的基因的相對表達水平。β-actin基因上游引物序列為5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游引物序列為5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，Linc00355上游引物序列為5’-GCAGACAGTTGTATCACGCC-3’，下游引物序列為5’-TCCGGAAGGTTGAGTGGTTG-3’；MAGE-A3基因上游引物序列為5’-GGCAGGCCTCCTGATAATCG-3’，下游引物序列為5’-GGTGAGCAGCTTCTTGGGAT-3’；CDKN1A（p21）基因上游引物序列為5’-TCTAGGAGGGAGACACTGGC-3’，下游引物序列為5’-TGTCTGACTCCTTGTTCCGC-3’。

1.5 CCK-8法和克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力

HCT116細胞分別轉染siNC、siLinc00355-1和siLinc00355-2 24 h后收集3組細胞，以2×103個/孔的密度接種于96孔板中，分別于1、2、3、4和5 d時加入CCK-8試劑，在酶聯免疫檢測儀波長450 nm處檢測各孔細胞的D值，并繪制細胞增殖曲線，具體檢測流程參閱試劑盒操作說明。

收集上述轉染24 h后對照組和實驗組細胞，以1×103個/孔的密度接種于6孔板中，靜置培養7～14 d。用10%甲醛溶液固定細胞30 min后，加入1%的結晶紫染色20 min，計數每個孔內的克隆數并拍照記錄（每個克隆含有50以上的細胞，直徑為0.3～1.0 mm）。

1.6 Transwell小室法檢測細胞的遷移及侵襲能力

收集上述轉染24 h后的3組細胞，用無血清DMEM培養液制成細胞懸液，以1×105個/室的密度接種于Transwell小室的上室中，并在Transwell下室中加1 mL完全培養液。培養24 h后除去培養液，用10%甲醛溶液固定細胞20 min，加入0.1%結晶紫染色20 min。清水沖洗去除染色液，用棉簽擦去未穿過小室膜的細胞。在倒置光學顯微鏡下（放大倍數為100倍）計數穿過小室膜的細胞數，分析細胞的遷移能力。

Transwell小室侵襲實驗，在Transwell小室的上室中預先鋪設Matrigel，其余檢測流程同Transwell小室遷移實驗，Transwell小室的上室中接種3組細胞48 h后，在倒置光學顯微鏡下（放大倍數為100倍）計數穿過小室膜的細胞數，分析細胞的侵襲能力。

1.7 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0統計學軟件處理研究數據，計量資料以表示，各實驗均獨立重復3次。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，多組間均數比較采用非參數檢驗（Kruskal-Wallis秩和檢驗）。組內兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關性分析采用Pearson線性相關分析；采用COX多因素回歸分析結腸癌患者死亡的影響因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌中差異表達的lncRNA

在TCGA數據庫中下載基因表達矩陣文件并提取結腸癌患者的臨床信息；lncRNA的數據（包括473例癌組織及41例配對癌旁正常組織），利用R語言edgeR包，根據差異倍數|Log2FC|＞2和校正P＜0.05篩選出差異表達的lncRNA。熱圖（圖1A）和火山圖（圖1B）分析結果顯示，與癌旁正常組織相比，在結腸癌中有871個lncRNA表達上調（圖中紅色標注）和259個lncRNA表達下調（圖中綠色標注）。

在這些差異表達的lncRNA中，根據生存分析篩選后發現，Linc00355表達與結腸癌患者不良預后相關，且在結腸癌中的功能未知，故選擇Linc00355進行后續研究。

2.2 Linc00355表達的預后價值

利用TCGA數據庫和GEO數據庫中的3組芯片（GSE23878、GSE41328和GSE39582）數據分析Linc00355在結腸癌中的表達和預后情況。結果（圖2A、圖2B和圖2C）顯示，Linc00355在結腸癌組織中高表達（P＜0.01，P＜0.01和P＜0.05）。

對TCGA數據庫檢索獲得的447例結腸癌（剔除26例信息不全數據）分析結果顯示，Linc00355表達水平與患者的TNM分期成正相關（P＜0.0001）（圖2D），且Linc00355高表達患者的總生存期（overall survival，OS）（圖2E）和疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）（圖2F）均明顯縮短（P值均＜0.05），GSE39583數據庫來源的患者同樣顯示（圖2F），Linc00355高表達者的OS明顯縮短（P＜0.05）。

采用Mann-WhitneyU檢驗分析TCGA數據庫中Linc00355表達水平與臨床病理特征之間的關系。結果（表1）顯示，結直腸癌組織中Linc00355表達與患者性別、年齡、T分期均無顯著相關性（P值均＞0.05），但與患者的臨床N、M分期及病理TNM分期有顯明顯的相關性（P＜0.01）。

COX多因素風險回歸模型分析結果（表2）顯示，Linc00355是結腸癌患者生存期的獨立預測因子，其表達水平越高，患者的OS期越短[風險比（hazard ratio，HR）＝1.601，95%可信區間（confidence interval，CI）為1.008～2.542，P＝0.046]。此外，年齡和T分期也是結腸癌患者OS期的影響因素。

2.3 Linc00355共表達mRNA網絡的構建與GO功能富集分析

為了探究Linc00355影響患者預后的原因，通過共表達分析預測與Linc00355相關的mRNA，共發現54個mRNA與Linc00355表達有相關性（圖3A），相關系數見表3。對這些基因進行功能富集分析，發現這些基因富集于如p53的信號轉導、細胞蛋白分解代謝過程，泛素蛋白轉移酶活性、蛋白質乙?；?、蛋白質小泛素相關修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化和細胞衰老等信號通路（圖3B）。這一結果提示，Linc00355在結腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲等過程中可能發揮重要調控作用。

Fig.1 Differentially expressed long non-coding RNA (lncRNA) in colon cancer based on The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset.A:Heat map of differentially expressed lncRNAs in colon cancer of TCGA database;B:Volcano map of differential lncRNA in colon cancer (red indicates up-regulation,green indicates down-regulation).logFC:Log2Fold change;FDR:False discover rate.圖1 基于TCGA數據庫獲得結腸癌中差異表達的lncRNA（A為熱圖；B為火山圖；紅色代表在癌組織中表達上調，綠色代表在癌組織中表達下調）

Fig.2 The correlation between Linc00355 expression and the prognosis of colon cancer patients.A-C:Linc00355 was up-regulated in tumor tissues compared with normal tissues in colon cancer cohorts of The Cancer Genome Atlas (TCGA) database (A) and Gene Expression Omnibus (GEO) database [GSE23878 (B)and GSE41328 (C)];D:Linc00355 expression was related to TNM stage;E-G:Survival analyses based on the expression of Linc00355 in the colon cancer cohorts of TCGA [overall survival (OS) (E) and disease-specific survival (DSS) (F)]and GSE39582 [OS (G)].圖2 采用TCGA及GEO數據庫分析Linc00355表達與結腸癌患者預后的相關性

2.4 Linc00355對結腸癌細胞生物學功能的影響

實時熒光定量PCR檢測結果（圖4A）顯示，與對照組比較，siLinc00355-1和siLinc00355-2組HCT116細胞中Linc00355的表達水平均明顯下調（P值均＜0.001），提示2條siRNA均可有效沉默Linc00355的表達。

CCK-8法（圖4B）和克隆形成實驗（圖4C）檢測結果顯示，敲低Linc00355表達后，siLinc00355-1和siLinc00355-2組HCT116細胞的增殖能力和克隆形成能力均明顯降低，差異有統計學意義（P值均＜0.001）。

Transwell小室法檢測結果（圖4D）顯示，敲低Linc00355表達后，HCT116細胞的遷移和侵襲能力均明顯降低（P值均＜0.001）。

上述結果提示Linc00355可促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。

表1 Linc00355表達水平與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性Table 1 Correlation between Linc00355 expression and the clinicopathological characteristics of patients with colon cancer Total＝447,n

表2 多因素COX風險模型分析Linc00355表達與結腸癌患者OS期的關系Table 2 Multivariate COX risk model analysis of the relationship between the expression of Linc00355 and the overall survival (OS) of patients with colon cancer

Fig.3 Analysis of mRNA co-expressed network of Linc00355 and Gene Ontology (GO) function enrichment analysis.A:Co-expression network of Linc00355;B:GO enrichment analysis of Linc00355 coexpressed genes.圖3 Linc00355共表達mRNA網絡（A）與GO功能富集分析結果圖（B）

表3 前20條Linc00355相關的共表達mRNATable 3 Linc00355 co-expression related mRNAs (TOP20)

Fig.4 Silencing Linc00355 expression inhibits the proliferation,migration and invasion of colon cancer HCT116 cells.A:The expression level of Linc00355 in HCT116 cells transfected with siRNA targeting Linc00355 (siLinc00355-1 and siLinc00355-2) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR,the expression level of Linc00355 was significantly reduced;B-C:The cell proliferation was detected by CCK-8 (B) and clone formation method (C),the cell proliferation ability was significantly reduced in Linc00355 knockdown HCT116 cells;D:The cells migration and invasion abilities were detected by Transwell method,the cells migration and invasion abilities were inhibited in Linc00355 knockdown HCT116 cells.HCT116 cells were transfected with negative control (NC)-siRNA (siNC) as the control.***P＜0.001 (n=3).圖4 沉默Linc00355表達抑制結腸癌HCT116細胞的增殖、遷移和侵襲能力

2.5 Linc00355可能通過調控MAGE-A3基因影響p53信號通路

為了驗證上述共表達分析結果，選擇評分最高的MAGE-A3及其下游靶基因CDKN1A（p53通路關鍵信號分子）進行了驗證。基于GSE38832數據集分析發現，Linc00355與MAGE-A3的表達存在顯著正相關（R＝0.552 3，P＜0.000 1）（圖5A），而與CDKN1A的表達水平則呈顯著負相關（R＝－0.406 8，P＜0.001）（圖5B）。

Fig.5 The relationship between Linc00355,melanoma antigen (MAGE)-A3 and CDKN1A.A:Linc00355 was positively correlated with the expression of MAGE-A3 in colon cancer (R=0.552 3,P＜0.000 1);B:Linc00355 was negatively correlated with the expression of CDKN1A (R=-0.406 8，P＜0.001);C.Silencing Linc00355 expression could inhibit the expression of MAGE-A3 and promote the expression of CDKN1A.***P＜0.001 (n=3).圖5 Linc00355與MAGE-A3和CDKN1A mRNA表達的相關性

實時熒光定量PCR檢測結果（圖5C）顯示，與對照組比較，2個敲低Linc00355表達組HCT116細胞中MAGE-A3 mRNA的表達水平均明顯下調（P值均＜0.001），而CDKN1A mRNA的表達水平均明顯上調（P值均＜0.001）。

上述結果提示，Linc00355可能通過影響MAGE-A3基因的表達，進而調控抑癌因子p21的表達，從而促進結腸癌的發生和發展。

3 討論

結腸癌是全球第3大常見的惡性腫瘤，居腫瘤相關死因第2位。據2020年統計結果顯示，將有超過190萬例新增結直腸癌病例和935 000例死亡病例，約占癌癥新發和死亡病例的10%[5]。研究表明。LncRNA的失調可能與腫瘤的發生、發展、轉移、耐藥及多種生物學表型相關[6]。呂夢佳等[7]發現，在非小細胞肺癌患者血漿中lncRNA MALAT1的表達水平明顯下調，lncRNA-ATB的表達明顯上調，血漿MALAT1及ATB可作為非小細胞肺癌的診斷指標。曾明曦等[8]發現，胃癌組織中lncRNA RP11-513G11.1的表達水平顯著高于癌旁組織及正常胃組織，與胃癌患者的TNM分期、淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤分化及生存狀態顯著相關。

LncRNA作為結腸癌生物標志物和治療靶點的潛能同樣不容忽視。SVOBODA等[9]發現，結腸癌患者血液中的lncRNA HOTAIR的表達水平顯著高于健康對照，且血液中HOTAIR的表達水平與患者的TNM分期、組織學分級以及OS期均有相關性。本課題組前期發現，在結直腸癌中高表達的lncRNA FEZF1-AS1通過結合并促進丙酮酸激酶2蛋白的穩定性，從而調控糖酵解和信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路，進而促進腫瘤的發生和發展[10]。并發現lncRNA UCA1和Linc00152分別通過調控miR-204-5p和miR-139-5p的表達促進結直腸癌的增殖和化療耐藥[11]。此外，還發現lncRNA SNHG6在結直腸癌中發揮促癌作用，且SNHG6的表達可作為一個新的不良預后指標[12]。

本研究首次發現，Linc00355可能是與結腸癌預后相關的新生物標志物。Linc00355在結腸癌組織呈現高表達，并與患者的不良預后相關；沉默Linc00355的表達水平體外可抑制結腸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力，提示Linc00355在結腸癌中發揮癌基因功能。隨后，基因共表達網絡及信號通路富集提示，Linc00355可能與細胞蛋白分解代謝、蛋白質泛素化、乙酰化、蘇木化，p53信號轉導及細胞衰老等多個生物學過程相關。而蛋白質修飾、p53信號轉導及細胞衰老與腫瘤的發生和發展密切相關。本研究中進一步驗證發現，沉默Linc00355表達可上調MAGE-A3 mRNA的表達水平。有研究表明，MAGE-A3可通過調控p53抑癌因子，影響p21、細胞周期蛋白D1（cyclin D1）及Bax的表達并調控與細胞增殖、凋亡相關的信號通路[13]。上述結果提示，Linc00355可能通過MAGE-A3基因影響p53信號通路進而影響結腸癌細胞的增殖。關于Linc00355調控結腸癌發生和發展的具體功能及機制的深入尚需進一步研究。

綜上所述，本文結果提示Linc00355有望成為一種新的結腸癌患者的預后標志物和治療靶點。