外泌體及其攜帶的非編碼RNA在卵巢癌診療中的研究進展

陳其臻，傅夏燕，焦雨帆，尹 喆，紀亞忠，王炎秋

卵巢癌是3大婦科惡性腫瘤之一，每年全球新發卵巢癌病例約23萬例，約15萬例女性患者死于卵巢癌，病死率位居婦科惡性腫瘤首位。由于早期卵巢癌患者無特異性臨床表現，缺乏有效的早期檢測手段，約75%的患者確診時已是晚期[國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期為Ⅲ期或Ⅳ期]，此外，卵巢癌患者易產生化療耐藥，術后容易復發轉移，因此晚期卵巢癌患者的5年生存率僅為29%[1-2]。這已嚴重影響全球女性的身心健康及生活質量，給社會和家庭帶來了沉重負擔。近年來的研究發現，外泌體（exosomes）非編碼RNA有望成為卵巢癌早期診斷及治療的新靶點。

外泌體是一類直徑為40～160 nm的細胞外囊泡，為連續的細胞膜內陷形成的多囊體，其含有細胞特異的DNA、RNA及蛋白質等生物活性物質，并廣泛分布于血液、唾液、卵泡液和子宮腔液等各種體液中[3]。大量的研究表明，外泌體在腫瘤的生長和轉移、副腫瘤綜合征的發生及腫瘤的化療耐藥等過程中發揮著重要作用[4]。目前，人類基因組中僅有2%的基因被翻譯為蛋白質，其余均為非蛋白質編碼部分，這些非蛋白質編碼基因被復制到數千個RNA分子中，即非編碼RNA。非編碼RNA根據長度可分為長鏈非編碼RNA（長度＞200個核苷酸）和短鏈非編碼RNA（長度為18～200個核苷酸）。ENCODE項目組研究發現[5]，非編碼RNA不僅會參與調節機體的生長和發育等生理過程，還會參與卵巢癌等腫瘤的發生及進展。本文將就外泌體非編碼RNA在卵巢癌中的研究進展進行綜述，以期為卵巢癌的診斷和治療提供一些新的思路。

1 外泌體及其生物學功能

外泌體產生過程包括細胞膜的雙重內陷和細胞內多囊小體（multivesicular bodies，MVBs）的形成，細胞內多囊小體包含多種腔內囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），最終，直徑為40～160 nm的腔內囊泡通過細胞內多囊小體質膜融合或胞吐作用以外泌體的形式分泌[6]。外泌體可不斷被細胞產生并不斷被細胞重吸收，其可能是新生成的外泌體，也可能為內源性外泌體重吸收后的混合物[7]。有研究表明，RAS相關結構域家族（RAS association domain family proteins，RASSF）蛋白、Bcl-2基因家族相關蛋白（Bcl-2 gene family proteins，Bcl-2）和神經酰胺等物質均參與到了外泌體的生物發生過程中，但其在該過程中的精確限速作用和功能仍需進一步研究[8-9]。

外泌體主要通過與靶細胞特異性受體結合、細胞膜融合或胞飲、內吞等內化機制實現細胞間的物質轉換與信息交流，如人黑素瘤細胞能通過細胞和細胞之間細胞膜的融合攝取外泌體[10]。然而目前尚不明確靶細胞攝取外泌體的方式是否會影響外泌體的定位、降解及功能等特性。已有大量研究表明，外泌體在免疫反應性疾病、病毒相關疾病、妊娠、心血管疾病、中樞神經系統疾病和惡性腫瘤的發生和進展中均發揮關鍵作用。

由于外泌體的脂質雙分子層結構可防止其內容物被降解或修飾，因此外泌體能夠在人體體液中穩定存在并被檢測到，其含量的變化可反映外泌體的起源細胞和機體病理生理的改變，這提示外泌體具有作為生物標志物的巨大潛力[11]。由于外泌體的納米性質，使其可作為化療藥物以及免疫調節劑等藥物的載體以進行靶向性治療，而且其生物利用度更高，藥物不良反應較少[3]，能在神經退行性疾病、免疫反應性疾病和惡性腫瘤等疾病治療中發揮作用如。

2 非編碼RNA在卵巢癌中的研究進展

根據長度不同，非編碼RNA可分為長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）（長度＞200個核苷酸）和短鏈非編碼RNA（長度為18～200個核苷酸），其中短鏈非編碼RNA包括微小RNA（microRNA，miRNA）、環狀RNA（circular RNA，CircRNA）和PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）等。根據功能性的不同，非編碼RNA可分為管家RNA和調節性非編碼RNA，調節性非編碼RNA包括miRNA、CircRNA和LncRNA等[12]。近年來，有越來越多的研究顯示，調節性非編碼RNA在卵巢癌發生及進展中發揮關鍵作用。此外，不同類型的非編碼RNA在腫瘤發生和發展中存在相互作用，如CircRNA和LncRNA可作為miRNA的分子海綿，形成龐大且復雜的競爭性內源性RNA網絡，通過調控靶基因的表達從而促進或抑制腫瘤的生長與轉移。

2.1 LncRNA和miRNA

LncRNA和miRNA調控網絡在腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用，LncRNA通過競爭結合一個或多個具有相同miRNA反應元件的miRNA，影響miRNA的表達水平，從而間接調控靶基因的表達，促進或抑制腫瘤的發生或進展（圖1）。

Fig.1 A brief overview of the most-studied and well-documented molecular functions of selected long noncoding RNA (LncRNA) and microRNA (miRNA).Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) is overexpressed in ovarian cancer (OC) and acts as a sponge for miR-503-5p,promoting cell proliferation through the janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) pathway.And MALAT1 can also be the main mediator of tumor invasion and migration,and epithelial-mesenchymal transition (EMT) through phosphoinositide 3–kinase (PI3K)/protein kinase B (PBK,AKT) signaling pathway in OC patients.Maternally expressed gene 3 (MEG3) is elevated in OC,which in turn increases the expression of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten (PTEN)，thereby inhibiting tumor growth by inhibiting the proliferation of tumor cells.Feline leukemia virus subgroup C receptor antisense RNA 1(FLVCR-AS1) has been reported to enhance the expression of yes-associated protein 1 (YAP1) by reducing miR-513,thereby enhancing cell migration and invasion.ANRIL directly inhibits the apoptosis of OC cells by reducing the level of p15INK4B and inducing the expression of Bcl-2.ABHD11-AS1 is significantly increased in OC and facilitates matrix metalloproteinase 2 (MMP2)-mediated and vascular endothelial growth factor(VEGF)-mediated angiogenesis by targeting RAS homolog gene family member C (RHOC).HOXA terminal transcriptional RNA (HOTTIP) could promote the secretion of IL-6,thereby up-regulating the expression of programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) in neutrophils,thus inhibiting the activity of T cells and ultimately accelerating the immune escape of OC cells.↑:Up-regulated;↓:Down-regulated.圖1 LncRNA和miRNA在卵巢癌中的發病機制

到目前為止，科研人員已進行了大量LncRNA在卵巢癌發病及進展中的機制研究。LncRNA-人肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）作為卵巢癌的一種癌基因，可通過調節細胞的增殖和凋亡促進腫瘤生長。SUN等[13]研究發現，LncRNA-MALAT1通過與miR-503-5p相互作用，負向調節miR-503-5p的表達，介導Janus激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號轉導及轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路的激活，從而促進卵巢癌細胞的增殖，并抑制癌細胞凋亡。此外，JIN等[14]研究發現，LncRNA MALAT1可通過磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號轉導通路，強化卵巢癌細胞的侵襲、遷移及上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）功能，從而促進了腫瘤生長。WANG等[15]研究發現，LncRNA-母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）和第10號染色體同源丟失性磷酸酶基因和張力蛋白（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）在卵巢癌細胞中表達下調，這提示LncRNA-MEG3可能通過正向調節PTEN的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖，阻斷細胞周期進程，促進腫瘤細胞凋亡，最終起到抑制腫瘤生長作用。YAN等[16]研究發現，貓白血病病毒C亞類受體反義RNA1（feline leukemia virus subgroup C receptor antisense RNA1，LncRNA FLVCR1-AS1），其作為一種長鏈非編碼RNA，可通過調控miR-513/Yes相關蛋白1（Yes-associated protein1，YAP1）信號通路促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和EMT過程。LncRNA ABHD11-AS1，位于人類第7號染色體q11.23區域，其通過正向調控RAS同源基因家族成員C（RAS homolog gene family member C，RhoC）的表達，并進一步調控RhoC下游分子基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表達，MMP-2可分裂層黏連蛋白-5（laminin 5，LN-5），增加內皮細胞的遷移及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的釋放，這刺激了癌組織周圍新生血管的生成，最終促進了腫瘤生長。HOXA遠端轉錄本（HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP）是同源盒基因（homeobox gene，HOX）的LncRNA，其在多種腫瘤進展中發揮重要作用。已有研究發現，HOTTIP的高表達可增加卵巢癌細胞中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達和分泌，IL-6通過與癌細胞周圍中性粒細胞表面的IL-6受體結合，激活STAT3通路，從而增加中性粒細胞表面程序性死亡分子配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）的表達，進一步抑制T細胞的活性，加速卵巢癌細胞的免疫逃逸，最終促進了卵巢癌的生長與轉移[17]。

2.2 CircRNA和miRNA

CircRNA是一類圓形閉合結構的非編碼RNA，是具有高度穩定性、保守性及多樣性的RNA分子。CircRNA具有miRNA分子海綿作用、蛋白質海綿作用和調節基因轉錄與翻譯等生物學功能。同時CircRNA的表達情況具有組織特異性及階段特異性，能夠反映機體不同的生理或病理狀態[18]。越來越多的研究表明，CircRNA在卵巢癌疾病進展過程中發揮重要作用。NING等[19]對4例卵巢癌組織及正常卵巢組織進行了CircRNA表達譜檢測，通過與正常卵巢組織進行對比，發現了4 388個不同程度表達的CircRNA，其中有2 556個CircRNA表達上調，1 832個CircRNA表達下調，采用實時熒光定量PCR法對CircRNA測序數據進行驗證，結果證實了其中6個CircRNA（CircBNC2、CircEXOC6B、CircFAM13B、CircN4BP2L2、CircRHOBTB3和CircCELSR1）的表達水平存在差異。ZHAO等[20]研究發現，小腦變性相關蛋白1反義RNA（cerebellar degeneration-related 1 antisense，CircRNA CDR1as），主要存在于人類和小鼠的大腦中，通過調節miR-1270/腫瘤細胞侵襲抑制因子（suppressor of cancer cell invasion，SCAI）信號通路可使卵巢癌對順鉑增敏，并發現CDR1as在順鉑耐藥患者的血清外泌體中表達下調。CHEN等[21]研究發現，hsa_circ_0061140通過發揮miR-370分子海綿的作用，可上調叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）的表達以促進卵巢癌的發生與發展。ZHANG等[22]研究發現，卵巢癌組織中hsa_circ_0051240表達明顯上調，hsa_circ_0051240通過抑制miR-637/人組織激肽釋放酶（kallikreins4，KLK4）軸促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，因此hsa_circ_0051240/miR-637/KLK4軸可作為卵巢惡性腫瘤治療的有效靶點。ZOU等[23]通過實時熒光定量PCR技術對78例卵巢癌組織及正常卵巢組織行Circ LARP4表達檢測，發現卵巢癌組織中Circ LARP4表達下調，此外ZOU等[23]還發現Circ LARP4的表達情況與FIGO分期及淋巴結轉移有顯著相關性，并通過COX風險比例回歸模型驗證了Circ LARP4表達下調為卵巢癌預后的獨立危險因素。

3 外泌體非編碼RNA在卵巢癌中的作用機制

隨著外泌體和非編碼RNA在腫瘤中的作用不斷被發掘，科研人員也注意到外泌體及其攜帶的非編碼RNA在卵巢癌發生和發展過程中的作用。同時還發現，癌細胞來源的外泌體不僅數量多于正常細胞，內容物也不盡相同[24]?，F已有大量研究證實，外泌體通過參與腫瘤細胞增殖、EMT、調節免疫狀態、腫瘤周圍血管生成和轉移前腫瘤微環境形成等過程促進卵巢癌的發生與進展。

Fig.2 Schematic diagram of the role of ovarian cancer (OC)-secreted microRNA (miR)-205 in tumour angiogenesis.Cancer-derived miR-205 can be transported to endothelial cells via exosomes,while exosomal miR-205 promotes angiogenesis in vitro and in vivo by regulating the phosphate and tension homology deleted on chromsome ten (PTEN)/protein kinase B (PBK,also known as AKT) pathway.圖2 卵巢癌分泌的外泌體miR-205在腫瘤血管生成中的作用示意圖

目前的相關報道主要集中在miRNA和CircRNA。HE等[25]通過共培養和外泌體標記實驗發現了miR-205以外泌體形式由卵巢癌細胞分泌至細胞外液中，并高效轉移到鄰近的內皮細胞中，此外脂筏蛋白相關通路在調節靶細胞對外泌體miR-205的攝取過程中起到重要作用。HE等[25]發現miR-205在卵巢癌患者血清中顯著富集，并且循環系統中富集的外泌體miR-205通過調控PTEN/AKT途徑誘導血管生成及腫瘤生長（圖2）。ZONG等[26]將卵巢癌細胞注入裸鼠腹腔，并分為實驗組與對照組，實驗組每隔2 d注射外泌體Circ WHSC1，對照組注射相同劑量的磷酸緩沖鹽溶液，結果顯示實驗組裸鼠腹腔的周長較對照組增長迅速，腹腔轉移結節灶數目較對照組顯著增多，腹腔間皮細胞原有的緊密結構消失。ZONG等[26]通過蛋白質印跡法檢測到，相較于對照組，實驗組腹膜間皮細胞黏蛋白1（mucin1，MUC1）的表達水平顯著升高，由此認為外泌體Circ WHSC1可被腹膜間皮細胞吸收，并誘導其發生EMT，同時MUC1高表達，可促進卵巢癌細胞與腹膜的黏附及轉移。

4 外泌體非編碼RNA在卵巢癌診療中的應用前景

4.1 外泌體非編碼RNA在卵巢癌早期診斷及判定預后的應用

早期卵巢癌無特異性癥狀且缺乏有效的檢查手段，這使得大多數患者在初次就診時就已為卵巢癌晚期（Ⅲ/Ⅳ期），卵巢癌晚期患者的5年生存率僅為29%，而早期卵巢癌患者（Ⅰ/Ⅱ期）5年生存率可高達92%。目前，針對晚期卵巢癌的常用治療手段為瘤體減滅術合并以鉑類藥物為基礎的化療治療，大部分患者在應用一線化療藥之后產生耐藥，并且復發率高。因此，尋找一個高效靈敏且方便快捷的早期檢測手段對卵巢癌的有效治療具有重大意義。

近期的研究表明，外泌體的磷脂雙分子層可保護其內容物非編碼RNA不被核酸酶降解，使其具有較高的穩定性，同時相較于循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）檢測，其在體液中含量更為豐富，這些優點均為利用外泌體對卵巢癌的早期診斷創造了條件[27]。MENG等[28]研究發現，上皮性卵巢癌患者的血清中外泌體miR-373、miR-200a、miR-200b和miR-200c的濃度明顯高于健康婦女，在有淋巴結轉移的晚期（Ⅲ～Ⅳ期）患者中，外泌體miR-200b和miR-200c的表達水平也均高于早期患者（Ⅰ～Ⅱ期），由此提示外泌體非編碼RNA可作為卵巢癌早期診斷的指標。VAKSMAN等[29]通過實時熒光定量PCR法對86例上皮性卵巢癌患者胸腔積液中的外泌體miRNA進行檢測，研究結果顯示，胸腔積液中外泌體miRNA-21、miRNA-23b和miRNA-29a的表達水平與患者的無進展生存期呈負相關（P＝0.01，P＝0.015和P＝0.009），而外泌體miRNA-21的表達水平與患者預后總生存期呈負相關（P＝0.017）；此外，通過COX風險比例回歸模型驗證了外泌體miRNA-21高表達為卵巢癌患者預后的獨立危險因素（P＝0.017）。雖然，目前關于外泌體非編碼RNA在卵巢癌中的研究仍相對較少，但非編碼RNA具有穩定性高、豐度大和組織特異性強等優勢，這使得外泌體非編碼RNA非常適合作為卵巢癌早期診斷及預后評估的生物標志物。

4.2 外泌體及其攜帶的非編碼RNA在卵巢癌治療中的應用

鑒于外泌體非編碼RNA以多種途徑參與了惡性腫瘤的發生和發展過程，可以此為切入點將外泌體非編碼RNA應用于腫瘤的治療中。目前已證實的途徑包括：（1）減少外泌體的產生和釋放；（2）清除外周血中存在的外泌體；（3）利用外泌體增強機體免疫能力；（4）作為藥物載體靶向傳送藥物。

AU YEUNG等[30]研究發現，外泌體miR-21可以從基質細胞轉移至卵巢癌細胞中，并通過靶向凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，APAF1）誘導卵巢癌細胞對紫杉醇的化療耐藥，由此提示抑制外泌體miR-21的產生及釋放可改善卵巢癌細胞對紫杉醇治療的敏感性，但該方法仍需進一步在體內實驗予以驗證。ALVAREZERVITI等[31]給小鼠注射了攜帶有針對β位淀粉樣前體裂解酶-1（β-site APP cleaving enzyme protein，BACE1）基因siRNA的外泌體后，小鼠腦中β-淀粉樣蛋白表達水平下調。雖然該方法目前在卵巢癌耐藥研究中尚無相關報道，但由此提示通過外泌體包裹siRNA下調卵巢癌相關耐藥基因表達將有望成為一個治療途徑。MARLEAU等[32]開發了一種類似于血液透析設備的裝置，其含有一種與外泌體高親和力的纖維物質，該機器以類透析機制達到去除循環系統中存在的外泌體。外泌體用于制備疫苗是腫瘤免疫治療的一個新方向，腫瘤細胞來源外泌體（tumor-derived exosomes，TEX）表面可負載主要組織相容性負荷體Ⅰ類分子（major histocompatibility complex Ⅰ，MHCⅠ）和腫瘤抗原，并可有效誘導T淋巴細胞反應；TEX的抗腫瘤作用很大程度上依賴樹突性細胞（dendritic cells，DCs），其作為無細胞性結構，具有容易制備及量產等優勢，是一種理想的腫瘤疫苗載體。TAGHIKHANI等[33]通過電穿孔的方法將miR-142裝載在TEX上，結果發現修飾后的TEX可以誘導DCs的成熟，強化其免疫功能，并對免疫抑制的腫瘤微環境起到一定程度的抗腫瘤作用。這一研究提示，TEX既可作為藥物或基因的載體對卵巢癌進行靶向治療，又可以作為一種腫瘤疫苗抑制腫瘤生長。KIM等[34]通過體外實驗證實，TEX包裹的紫杉醇可直接作用于耐藥的腫瘤干細胞，其對耐藥腫瘤細胞的細胞毒性為游離紫杉醇的50倍?？傊?，TEX作為藥物載體具有免疫原性低、藥物損耗率低和組織中易于擴散等優點。目前外泌體非編碼RNA在卵巢癌治療中的應用仍較少，需要進一步完善大樣本的體內試驗及具體免疫機制的研究。

5 總結與展望

卵巢癌作為3大婦科惡性腫瘤之一，由于其早期診斷率低、復發率高及化療耐藥，其病死率位居婦科腫瘤首位。近年來，外泌體非編碼RNA與腫瘤的關系已成為熱門研究領域，外泌體非編碼RNA結合了外泌體及非編碼各自的優勢，可作為卵巢癌早期診斷及預后評估的生物標志物。同時，外泌體非編碼RNA亦可作為卵巢癌治療的特異性靶點，減少化療耐藥的發生，降低藥物不良反應，改善患者的治療效果及預后。然而目前有關外泌體非編碼RNA的研究相對較少，非編碼RNA在外泌體中的富集及降解機制尚不明確。此外，外泌體非編碼RNA作為腫瘤標志物的靈敏度及特異性如何仍需進一步研究。外泌體非編碼RNA在卵巢癌治療方面的應用仍存在亟待解決的問題，體外外泌體過濾裝置不具有選擇性，非腫瘤來源外泌體的減少是否對卵巢癌的疾病進程有影響需要進一步研究，特異性消除或抑制外泌體非編碼RNA的分泌及如何通過外泌體非編碼RNA逆轉化療耐藥的發生仍需進一步研究。