通過LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路探討酒精性肝病發(fā)病機(jī)制

牟文玲 陳事如 吳振婷 常鴻杰 馮夢瑤 周航 胡立華

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的一組肝臟疾病的總稱。世界各國的發(fā)病率和隨之帶來的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)均隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展呈上升趨勢[1-4]，是國內(nèi)外肝臟疾病研究的重點(diǎn)，酒精已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝臟損害的第二大病因，ALD正在成為威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，對其發(fā)病機(jī)制的探索和研究刻不容緩。ALD做為臨床常見的肝臟疾病，因其發(fā)病機(jī)制不明，一直缺乏行之有效的治療。一旦發(fā)病過程中的扳機(jī)機(jī)制啟動(dòng)，患者即使嚴(yán)格忌酒，仍無法控制疾病的進(jìn)程。而臨床多采取簡單的保肝降酶對癥治療，無法從根本控制或逆轉(zhuǎn)肝臟病理生理改變。如明確LPS-TLR4/MD-2-TNF-α通路的作用環(huán)節(jié)以及該信號通路在酒精性肝損傷中的作用機(jī)制，可為篩選治療ALD的分子靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本課題從體外、體內(nèi)兩方面研究探討該信號通路的影響和作用機(jī)制，同時(shí)選擇性阻斷LPSTLR4/MD-2-TNF-α信號通路分子，探討該通路在ALD中的作用機(jī)制。為防治ALD提供科學(xué)依據(jù)并為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和研究方向。

1 資料和方法

1.1 一般資料

SD雄性大鼠，ALD大鼠尾靜脈注射內(nèi)毒素LPS 50 μg/kg，鼠重90 min。選擇性體內(nèi)阻斷劑分別應(yīng)用大鼠anti-TLR4、anti-MD-2（以上來自Abcam公司）經(jīng)腹腔注射治療。試劑：40%酒精、50%酒精、水合氯醛、選擇性體內(nèi)阻斷劑。儀器設(shè)備：超速和高速離心機(jī)；PCR儀；電轉(zhuǎn)移儀；芯片掃描儀、芯片雜交儀、自動(dòng)基因序列分析儀、DNA合成儀、凝膠成相分析儀，高效液相分析儀，基因芯片點(diǎn)樣儀、自動(dòng)基因序列分析儀、-80℃低溫冰箱和Parmacia電泳儀等。

1.2 研究方法

1.2.1 體內(nèi)研究 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠按每周測定的體質(zhì)量每日早晚各給予1次白酒灌胃，前4周每日給予40%酒精灌胃（8 g/kg），2次灌胃時(shí)間間隔超過8 h，自第5周開始，每日給予50%酒精灌胃（9 g/kg），至8周末。任取灌胃8周末一只大鼠禁食12 h后，以10%的水合氯醛3 mL/kg進(jìn)行麻醉，取血液離心采用分光光度法分別檢測血清ALT、AST、ALP、GGT、TCH、TG、TB。取出肝臟，用于常規(guī)石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色并觀察其肝臟的組織學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)的改變、備用。

觀察項(xiàng)目：

（1）取肝臟進(jìn)行組織培養(yǎng)并測定培養(yǎng)液中TNF-α的含量：取肝組織約10 mm×4 mm×0.4 mm，在冰浴的William's E medium培養(yǎng)液中洗去血液，放入含10%小牛血清的William's E medium培養(yǎng)液中進(jìn)行組織培養(yǎng)（5%CO2，18%O2，37℃），每個(gè)培養(yǎng)瓶中放入兩塊上述大小的肝組織。取不同時(shí)間點(diǎn)（0 h，1 h，2 h）的培養(yǎng)上清測定TNF-α的含量（以每克組織定量），并測量培養(yǎng)瓶中的肝組織重量。

（2）肝組織中LBP、CD14、TLR4、MD-2、TNF-α蛋白表達(dá)變化：Western blot方法檢測。

（3）肝組織中LBP、CD14、TLR4、LBP、MD-2、TNF-α m RNA表達(dá)：real time RT-PCR方法檢測。

（4）肝組織中NF-κB活性：Western blot和EMSA方法檢測。肝組織學(xué)損害用HE、PAS和Masson’s染色病理切片進(jìn)行評估。

1.2.2 體外研究 分離ALD大鼠模型肝臟Kupffer，常規(guī)建立細(xì)胞培養(yǎng)體系。分別采用TLR4/MD-2過表達(dá)慢病毒載體及RNAi轉(zhuǎn)染肝臟Kupffer，檢測Kupffer表型及功能的變化、TLR4/MD-2通路相關(guān)分子的表達(dá)變化以及細(xì)胞因子產(chǎn)生的變化。

1.3 觀察指標(biāo)

選擇表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒（lentivirus）載體包裝質(zhì)粒：pRsv-REV、pMDlg-pPRE和pMD2G包裝質(zhì)粒，同時(shí)分別構(gòu)建含TLR4和MD-2特異性siRNA序列的質(zhì)粒，用表達(dá)相應(yīng)基因的siRNA病毒分別感染肝臟Kupffer細(xì)胞，分別干擾TLR4和MD-2的表達(dá)。以表達(dá)無功能siRNA慢病毒為陰性對照。以實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot檢驗(yàn)慢病毒siRNA的基因沉默效果，每個(gè)基因設(shè)計(jì)2～3條siRNA，選取基因沉默效果最佳者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)GFP細(xì)胞比例，監(jiān)測慢病毒對細(xì)胞的感染效率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

臨床觀察記錄、臨床試驗(yàn)資料和數(shù)據(jù)由專人管理。計(jì)量資料組內(nèi)前后對照采用配對t檢驗(yàn)，采用（±s）表示，組間差異顯著性采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，采用（n，%）表示，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)或者Spearman秩相關(guān)系數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在顯著性差異表達(dá)的Pathway中LPS代謝通路呈上調(diào)趨勢，且有多個(gè)差異miRNA同時(shí)調(diào)控此代謝通路。同時(shí)選擇性阻斷LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路分子，可以降低乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物及引起的代謝紊亂，減緩炎癥反應(yīng)引起的損傷。

3 討論

內(nèi)毒素主要成分是脂多糖（LPS），是腸道革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的重要組成成分，在菌體自溶或被裂解時(shí)釋放出來。長期大量的飲酒，可刺激腸道致?lián)p傷，使腸道菌群上移，引起內(nèi)毒素腸滲漏，使血中內(nèi)毒素含量升高，即腸肝循環(huán)。臨床研究表明，酒精性肝病患者血漿內(nèi)毒素水平較正常受試者及非酒精性肝硬化患者升高，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦有類似結(jié)論[5-7]?，F(xiàn)有研究支持LPS—Kupffer細(xì)胞活化—TNF-α等細(xì)胞因子分泌—肝臟炎癥損傷這一途徑：即LPS進(jìn)入血液后，通過LPS的結(jié)合蛋白LBP與Kupffer細(xì)胞膜表面的內(nèi)毒素受體（endotoxin receptors on Kupffer cell membrane，CD14）結(jié)合，經(jīng)跨膜受體TLR4等Toll樣受體家族（Toll like receptors，TLRs）參與，完成LPS跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入胞內(nèi)，激活肝Kupffer細(xì)胞，使存在于胞漿的I-κB磷酸化釋放NF-κB（nuclear factor-kappa B）。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，從而啟動(dòng)炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-α，TNF-α）的轉(zhuǎn)錄。TNF-α等促炎因子的存在又可進(jìn)一步活化NF-κB，形成惡性循環(huán)。TNF-α是Kupffer細(xì)胞活化產(chǎn)生的主要炎癥細(xì)胞因子，通過其受體TNFR1發(fā)揮多種細(xì)胞效應(yīng)，如通過活化內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮促中性白細(xì)胞聚集的效應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體腫脹、破壞及細(xì)胞凋亡壞死，從而發(fā)生肝損傷。

新近的研究發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)需要一種稱為髓 樣 分 化 蛋 白 -2（myeloid differentiation protein-2，MD-2） 的輔助[8-13]：血漿中的LPS首先和肝臟產(chǎn)生的LPS結(jié)合蛋白（LPS binding protein，LBP）結(jié)合，由LBP將LPS轉(zhuǎn)運(yùn)到CD14（cluster of differentiation-14）。但是CD14缺乏跨膜區(qū)和胞漿內(nèi)段，不能將LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，因此它只能將LPS傳遞給下游的TLR4/MD-2受體復(fù)合物。最近研究報(bào)道LPS可上調(diào)Kupffer細(xì)胞中TLR4/MD-2基因和蛋白的表達(dá)，并合成細(xì)胞因子TNF-α，抗TLR4的抗體能抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的生成，TLR4/MD-2單克隆抗體可以保護(hù)肝臟免于LPS引起的致死性肝損傷。TLR4和它伴侶分子MD-2可能在LPS—Kupffer細(xì)胞活化—TNF-α等細(xì)胞因子分泌—肝臟炎癥損傷這一途徑中發(fā)揮受體結(jié)合、促細(xì)胞因子分泌的重要作用。

本課題從體外、體內(nèi)兩方面研究：體外觀察LPS誘導(dǎo)kuffer細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的干預(yù)的作用和強(qiáng)度。體內(nèi)研究采用大鼠LPS尾靜脈注射誘導(dǎo)TNF-α釋放的模型，分離肝臟進(jìn)行體外組織培養(yǎng)，探討該信號通路的影響和作用機(jī)制，同時(shí)選擇性阻斷LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路分子，探討該通路在ALD中的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在顯著性差異表達(dá)的Pathway中LPS代謝通路呈上調(diào)趨勢，且有多個(gè)差異miRNA同時(shí)調(diào)控此代謝通路。

綜上所述，通過體內(nèi)特異性單抗阻斷LPS-TLR4/MD-2-TNF-α信號通路可以降低乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物及引起的代謝紊亂，減輕炎癥反應(yīng)引起的損傷。本課題可為篩選治療ALD的分子靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為防治ALD提供科學(xué)依據(jù)并為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)和研究方向。