天然橡膠生物合成分子調控機制的研究進展

楊起航，劉坤杰，劉 樂，王 斐，李鴻彬，謝全亮

（石河子大學 生命科學學院和農學院，新疆 石河子 832003）

天然橡膠（NR）是產膠植物自身合成的類異戊二烯聚合物。到目前為止，巴西橡膠樹（H.brasiliensis，以下簡稱橡膠樹）幾乎是NR唯一來源，由于受橡膠樹種植面積有限、難以遺傳改良、葉枯病危害大以及人力物力有限的影響，全球NR產量達到極限[1]，這一問題至今無法突破。2019年我國自主生產NR 85.6萬t（約占總消費量的20%），80%的NR仍然依賴進口，面臨著進口集中度高、貿易限制和國內需求不斷增長等問題，一旦NR進口來源阻斷，對我國各行各業都十分不利[2]。當前，NR生物合成的精確調控機制仍然不清楚，這也成為限制提高NR產量進度最主要因素。因此，橡膠樹和其他產膠植物的橡膠生物合成機制仍然有待深入解析。NR生物合成機制的精確解析有利于開發新的產膠植物，以解決橡膠樹橡膠來源單一的問題，同時也對NR生物合成的遺傳機制研究具有深遠的意義。

1 產膠植物基因組學的研究進展

世界上有超過2 500種產膠植物，但僅少數產膠植物可被人類利用，例如：橡膠樹、橡膠草、杜仲以及銀膠菊。2013年，橡膠樹基因組草圖首次破解[3]，2016年，C.R.TANG等[4]進一步深度測序，獲得橡膠樹93.8%（1.47 Gb）的基因組，約43 792個蛋白質編碼基因。在橡膠樹基因組中鑒定了94個屬于20個基因家族的橡膠生物合成相關基因。18個基因屬于甲羥戊酸（MVA）途徑，22個基因屬于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）途徑，15個基因屬于細胞質中引發劑合成；39個基因屬于橡膠粒子相關的橡膠延伸基因，這其中包括18個橡膠延伸因子（REF）/小橡膠粒子蛋白質（SRPP）。2020年，J.LIU等[5]將基因組裝配到橡膠樹18條假染色體上，鑒定了許多與產膠相關的候選基因。2018年我國完成首個杜仲基因組測序，其環境適應機制可歸因于逆境反應或次生代謝產物相關基因的高表達/顯著擴張。杜仲與橡膠樹的異戊二烯焦磷酸（IPP）主要來自MVA途徑。而杜仲與真菊Ⅰ和Ⅱ類分化時間可追溯到約1.29億年前，經古老的基因組3倍化復制，卻無近期基因組復制發生[6]。研究顯示，雖然橡膠樹和杜仲中SRPP/REF基因家族都存在顯著擴張的現象，但橡膠樹中SRPP和REF基因同時參與順式-1，4-聚異戊二烯的NR合成，而杜仲橡膠合成只有SRPP基因參與。杜仲中法尼基焦磷酸（FPS）基因家族存在擴張并出現功能分化，產生了具有反式長鏈橡膠合成功能的Ⅱ類FPS基因，所以杜仲合成以反式-1，4-聚異戊二烯為主的NR。此外，橡膠樹和杜仲SRPP/REF和FPS基因家族成員屬不同分支，說明雙子葉植物中橡膠生物合成為多起源。

2017年橡膠草基因組測序由中國科學家率先完成并正式對外公布[7]，基因組約為1.29 Gb，46 000多個基因，共鑒定102個橡膠生物合成相關候選基因，其中MVA途徑有6個步驟，40個基因；MEP途徑有8個步驟，23個基因，以及19個基因用于引發劑合成和20個基因用于橡膠粒子相關的橡膠延伸蛋白質。深入分析橡膠草基因組數據，可以發現一些橡膠草自交衰退相關的可能候選區域。然而，銀膠菊基因組的研究還未系統展開。

2 NR生物合成分子調控機制

NR生物合成主要發生于產膠植物細胞溶質中MVA途 徑 和 質體 中MEP途 徑。MVA和MEP途徑合成橡膠前體單分子IPP，其中參與IPP和橡膠聚合物（IPP×n）形成的基因稱為橡膠生物合成基因，這些基因在橡膠樹中已被初步鑒定[4]。在MVA途徑所有基因家族中，每個基因家族至少有一個基因成員在橡膠樹的膠乳中鑒定并高調。然而，在MEP途徑的22個基因中，僅DXS7和DXS10基因在膠乳中顯著表達，這表明在橡膠樹中IPP的合成以MVA途徑為主，也進一步說明MVA途徑是NR生物合成的主要途徑。

在短角蒲公英中，鑒定了3種羥基甲基戊二酰-CoA還原酶（HMGR）基因，其功能分析表明TbHMGR1參與NR生物合成前體的調控[8]。橡膠草基因組的TkHMGR1和TkHMGR2主要在根中表達，在根膠乳中表達最高[7]。HMGR上游的3個基因，即三磷酸腺苷（ATP）、檸檬酸裂解酶（ACL）和乙酰乙酰-CoA硫解酶（AACT）的表達，與短角蒲公英膠乳中類異戊二烯合成前體的合成相關。此外，短角蒲公英膠乳中ACL，AACT和HMGR在擬南芥中過量表達導致這3種酶的活性和積累增加，從而導致甾醇、五環三萜、順式-1，4-聚異戊二烯以及角鯊烯等次生代謝產物增加，這可能具有一定的工業價值[9]。目前，在蒲公英屬和其他產膠植物中，已鑒定了幾種NR生物合成相關基因，其中包括維持橡膠粒子穩定性的SRPP和REF以及控制橡膠鏈延長的順式-異戊烯基轉移酶（CPT）和與CPT相互作用[橡膠轉移酶（RTA）或類CPT（CPTL）]的橡膠轉移酶活化劑等[10]。然而，它們的相互關系以及精確調控機制仍不清楚，不同產膠植物的NR生物合成機制仍有待深入解析。

在橡膠樹基因組中MVA途徑6個基因已被克隆并分析了它們的表達水平。其中，HbAACT1，HMGS1，HbMVK，HbPMK和 HbMVD在 膠 乳 中 高度表達，并且在酵母中MVA途徑缺失突變已補充鑒定。然而，羥甲基戊二酰-CoA合成酶（HMGS）和HMGR的多個基因具有不同的表達模式[11]。據報道[12]，HMGR1參與NR生物合成，而HMGS活性與膠乳中橡膠含量正相關。HbHMGR1的過表達增加了煙草植物中的甾醇積累[12]。橡膠樹和非橡膠植物朝鮮薊（Cynara scolymus）在MEP途徑和橡膠引發劑合成中酶的基因數相似，但產膠植物中MVA途徑和橡膠延伸蛋白質中基因數更多[7]。橡膠粒子涉及橡膠聚合酶和蛋白質的位置，橡膠轉移酶（RT-ase）復合物可能包括參與底物結合、催化、相對分子質量調節和橡膠聚合物正確引導到橡膠粒子內部的蛋白質。然而，許多其他蛋白質也與橡膠粒子有關。這些蛋白質包括膜結合蛋白質和其他僅與橡膠粒子相關的蛋白質，它們可以很容易地被置換[13]，在沒有可溶解RT-ase活性的情況下，明確鑒定哪些蛋白質直接參與NR生物合成的調節仍具有挑戰性，并且遺傳方法在鑒定嘗試中也起關鍵作用。一些橡膠粒子蛋白質似乎與橡膠粒子的結構和完整性有關。在轉錄組研究方面，橡膠樹鑒定了1 709個新的表達序列標簽（EST）簡單重復序列（SSR），并且在MVA和MEP途徑的NR生物合成途徑中共驗證了78個單核苷酸多態性（SNP）標記[14]。橡膠草與橡膠樹相比，轉錄組中橡膠產量相關性狀的標記性狀關聯分析發現了與高橡膠相關的更多SNP標記[15]。有趣的是，橡膠樹的MEP途徑中各基因的表達豐度表明，MEP途徑比MVA途徑參與該物種的橡膠產量更重要。此外，在參與菊粉生產的基因中發現了比在NR生物合成中更多的SNP，表明NR生物合成基因的高度保守性。冷馴化的銀膠菊轉錄組中總共有11 748個EST，發現大多數EST來自編碼應激反應相關蛋白質基因，而只有1%的EST鑒定與NR生物合成相關[16]。

3 小橡膠粒子蛋白質在NR合成中作用的研究進展

橡膠粒子膜上豐富的SRPP能與REF相互作用，這表明REF可能在橡膠粒子膜上以同多聚體或異多聚體的形式存在。SRPP同源基因已在橡膠植物和非橡膠植物（擬南芥）中鑒定，并指出SRPP家族成員是與抗逆相關的蛋白質家族[17]。REF是橡膠粒子膜上的蛋白質，可能與膠乳植物的NR生物合成有關，盡管橡膠粒子膜上蛋白質復合物的作用并未給出更多定義，但在各種橡膠樹中REF的轉錄水平已顯示與膠乳產量成正相關。通過無細胞翻譯偶聯系統將重組REF引入橡膠粒子洗脫液會降低其凝結作用，REF可能參與了橡膠粒子的穩定或維持。使用酵母雙雜交系統篩選REF相互作用蛋白質導致分離橡膠橋鏈蛋白（HRBP）作為相互作用蛋白[18]。橡膠樹中橡膠粒子結合蛋白質之間的相互作用網絡分析表明，REF可以與HRBP相互作用。盡管REF（14.7 kDa）比SRPP（22.3 kDa）短得多，REF也可歸為SRPP系列，因為REF與SRPP同源。但是在其他植物物種中并未發現REF直系同源物，這兩種蛋白質具有顯著的同源性（約72%的氨基酸有同源性）。REF與HRBP之間相互作用表明，HRT1-HRBP復合物可以進入橡膠粒子膜上包含豐富SRPP和REF的結構網絡中，從而錨定在橡膠粒子膜上產生功能。SRPP和REF確實在橡膠樹膠乳凝固和橡膠粒子穩定中起重要作用[19]。SRPP通過在脂質頭基上顯示一種“覆蓋效應”而不干擾膜完整性來穩定橡膠粒子[20]。脂質液滴的相關研究進一步驗證了這種想法，脂質液滴分隔的是三酰基甘油而不是橡膠聚合物，其中HbSRPP的同源物被鑒定為脂質液滴相關蛋白質，并且在應激條件下是維持脂質液滴所必需的[21]。銀膠菊和橡膠草中橡膠粒子均分別含有HbSRPP同源物PaGHS和TkSRPP[22]。

在橡膠草基因組中，檢測到1個TkREF和9個TkSRPP基因組成的家族成員。基于產膠和非產膠植物的REF/SRPP蛋白質系統發育的樹，發現大多數橡膠草與橡膠樹SRPP基因屬于兩個獨立的分支，這表明橡膠粒子穩定機制在兩個物種中是不同的。以前的研究也發現了類似的結論，可能是由于NR生物合成是植物界的一個獨立演化過程[7]。橡膠草基因中大多數REF/SRPP基因在膠乳和根中表現出特異性高表達水平。其中SRPP有4種 同 種 型（TkSRPP1，TkSRPP2，TkSRPP3和TkSRPP4）在膠乳中的轉錄表達水平比在其他組織中高得多，而其他4種異構體在根中轉錄表達水平顯著高于其他組織。這說明REF/SRPP基因可能在橡膠草的NR生物合成中起重要作用。短角蒲公英膠乳中TbREF定位于橡膠粒子中，屬于非典型SRPP家族蛋白質[23]。據報道，排除TbREF在橡膠中的積累具有負面影響，該蛋白質在NR生物合成中有一定的作用，但仍不清楚是否與其他組分（如TbRTA）有相互作用。

4 產膠植物產膠機制的研究進展

目前研究比較廣泛的橡膠植物是菊科蒲公英屬的橡膠草[24]。對橡膠草環境適應性的研究[25]表明，橡膠草可廣泛種植在高緯度或低緯度地區。多年生橡膠草根部可產生比橡膠樹NR具有更高相對分子質量的NR。此外，橡膠草還可以產生菊粉，其為生產生物乙醇的原材料[26]。由于橡膠草具有種植面積廣、成熟時間短、機械化種植和采收容易等優勢，使得其成為第二大或替代橡膠樹的產膠植物。由于對橡膠草更容易進行遺傳改良、橡膠合成機制以及分子育種等研究，使其成為探討NR生物合成機制的理想模式植物。野生橡膠草馴化在未來有較好的前景[27]，但由于其高雜合性和自交不親和性等因素，未來橡膠草作為商業上可行的第二大或替代傳統橡膠樹的產膠植物，其NR生物合成調控機制的研究仍然面臨嚴峻挑戰。

5 結語

產膠植物NR生物合成調控機制精確解析與NR產量提升緊密相關，盡管研究者們對類異戊二烯生物合成途徑以及NR生物合成中涉及的基因和蛋白質的解析已經取得了很大進展，但對NR生物合成分子機制的精確解析仍然存在諸多問題。目前，NR生物合成可能是從多萜醇合成酶/十一烯醇/丙烯共聚物和CPT失去了它們特定的寡聚鏈終止基序，使它們能夠催化縮合合成。細菌、酵母和植物中的互補和異源表達，未能使長鏈橡膠分子產生，并且對類異戊二烯終產物的增強有限[28]。在遺傳改良試驗中使用順式或無標記基因載體可以改善類異戊二烯最終產物。類似方法也可用于提高NR產率和相對分子質量。到目前為止，NR生物合成機制及其底物和活化劑的復雜性阻止了橡膠轉移酶復合物及其橡膠轉移酶活性的完全重構[29-30]。深入分析細胞溶質中MVA途徑和質體中MEP途徑之間的代謝通量，包括區室串擾和反饋環，將非常有助于選擇最合適的遺傳轉化，以獲得轉基因植物并提高橡膠含量。類異戊二烯生物合成基因/蛋白質的過表達未能提高最終產物的產量，這可能與負反饋機制或下游限速酶的功能有關，但這還未解析清楚。新基因編輯、代謝組學、蛋白質組學和基因組學等其他先進技術工具的出現，應該可以研究單個或多個NR相關基因的作用，并可能提高產膠量。

NR合成生物學的出現及其與代謝工程的協同作用為創造定制的體外模擬細胞橡膠合成提供了巨大的機會。產膠植物的基因組、轉錄組學和蛋白質組學可能為增加橡膠基質提供有效的策略。橡膠草是一個潛在替代橡膠樹的最有前景的菊科植物，此外，對橡膠REF/SRPP兩個重要基因家族來說，已經發現了它們不同的進化軌跡。 但是SRPP基因家族精確調控機制還未解析清楚，相信SRPP對NR生物合成調控機制的研究會為提高NR產量提供寶貴的技術，并促進替代橡膠樹的產膠作物開發和利用。這些研究結合分子機制、育種、農藝，并將收獲技術與提取工藝相結合，將有助于精確解析橡膠草的NR合成機制和提高其產膠量。預計此舉可以將橡膠草的NR產量提高到商業上可行的水平，在未來幾年極大地加快其替代橡膠樹的研究進程。