二甲雙胍通過調控細胞自噬對糖尿病大鼠血管內皮凋亡的影響

王卓怡，蔡建紅，張月嬋，支遙

(張家港市中醫醫院藥劑科，江蘇 張家港 215600)

糖尿病是危害人類健康最常見、最主要的慢性代謝病之一。以往研究顯示，全球糖尿病在成人中的發病率為8.8%，患者人數達4.15億[1]。其中，中國糖尿病的患病人數為1.1億，居全球首位[1]。第六次全國糖尿病流行病學調查顯示，中國成人糖尿病患病率高達11.6%[1]。

二甲雙胍(metformin，MET)是一種經典的降糖藥物。研究證實，MET可以減少糖尿病誘發的多種心血管疾病[2-4]。但是MET對糖尿病血管損傷的保護作用機制尚不清楚。自噬是一把“雙刃劍”，在生物體的生理和病理學過程中發揮重要作用[5]。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62和Beclin-1被認為是自噬的標志物[6]。既往研究證實，高糖處理人臍靜脈內皮細胞48 h可以上調LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，下調p62，進而導致人臍靜脈內皮細胞功能障礙[7]。另外，在高糖誘導的血管內皮細胞凋亡中，激活自噬能夠抑制細胞凋亡的發生，表明自噬和凋亡可能存在某種相互調節的關系。細胞凋亡在糖尿病血管損傷中起重要作用，參與糖尿病血管內皮損傷的病理過程。研究顯示，高糖可以上調Bax，下調Bcl-2表達，誘導內皮細胞凋亡，進而導致糖尿病血管內皮損傷[8]。但目前細胞自噬與內皮細胞凋亡的關系尚不完全明確。本研究通過構建糖尿病大鼠模型，旨在探討MET對糖尿病大鼠血管內皮損傷的影響及其分子調控機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 選取SPF級雄性SD大鼠45只，體重180～220 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2019-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2019-015，適應性飼養1周，飼養期間給予自由飲水和飲食，光照白晝各12 h。

1.1.2實驗試劑 Bax抗體(批號：14796)、Bcl-2抗體(批號：15071)、LC3抗體(批號：19848)、p62抗體(批號：7814)、Beclin-1抗體(批號：54101)購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購自武漢博士德公司(批號：3697)；辣根過氧化物酶標記兔二抗(批號：A0277)、辣根過氧化物酶標記鼠二抗(批號：A0286)、一抗稀釋液(批號：P0256)、二抗稀釋液(批號：P0258)購自上海碧云天生物技術有限公司。實驗所需培養基和耗材購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3主要儀器和設備 組織勻漿儀(武漢維塞爾生物科技有限公司生產，型號：ZW800G)；-80 ℃超低溫冰箱(青島海爾集團生產，型號：YY-JJ2)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司生產，型號：ULT-25NE)；高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司生產，型號：Allegra X-15R)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus光學工業株式會社生產，型號：TC-XDS-500C)；電鏡(北京京科瑞達科技有限公司生產，型號：NE910)；免疫印跡檢測裝置(美國Bio-Rad伯樂公司生產，型號：DYCZ-40D)；高純水機(美國Millipore公司生產，型號：HAD-Green-30T)。

1.2實驗方法

1.2.1糖尿病大鼠分組與動物模型構建 將實驗動物采用隨機數字法分成正常對照組、糖尿病組、MET藥物處理組，每組15只。糖尿病組和MET藥物處理組大鼠腹腔內注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)，對照組大鼠注射等量的0.9% NaCl注射液。鏈脲佐菌素注射完成后采用血糖儀檢測大鼠血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L可視為造模成功。造模成功后，MET藥物處理組大鼠給予40 mg/kg的MET，每日1次；糖尿病組大鼠灌服等劑量的0.9% NaCl注射液，兩組大鼠均持續灌胃8周，對照組大鼠持續喂養8周。檢測三組大鼠禁食12 h后的體重、血糖和胰島素水平。待給藥時間到達進行大鼠主動脈血管組織取材，備用。

1.2.2蘇木精-伊紅染色 ①固定：將取得的大鼠主動脈血管組織標本放置于4%的多聚甲醛內進行固定，時長約30 min；②脫水：將血管組織分別放置于70%、80%、90%、95%、100%不同濃度的乙醇進行梯度脫水；③透明：采用二甲苯將血管組織標本透明2次；④浸蠟：將透明標本組織放置在溶化好的石蠟里，置于溶蠟箱在65 ℃下保溫2 h；⑤包埋：觀察石蠟完全浸入到組織中后進行包埋，待其冷卻凝固為蠟塊；⑥切片：標本組織蠟塊用切片機在其中部自動橫行切取3張4 μm厚的薄片；⑦在脫蠟和水洗后，采用蘇木精進行染色，保持3 min，繼續水洗之后藍化，保持10 min，使用1%的鹽酸乙醇進行分化，保持20 s，最后伊紅染色，保持5 min；⑧封片：使用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇依次進行脫水，各自保持3 min，使用二甲苯進行透明，保持5 min，最后使用中性樹脂膠完成封片。觀察三組大鼠主動脈形態變化。

1.2.3蛋白質免疫印跡 ①取出大鼠的主動脈血管，剪碎后放置于1.5 mL的組織研磨管內，并按照1∶2比例加入組織裂解液放置在已經預冷后的組織勻漿儀中進行研磨；②高速離心機4 ℃ 12 000×g離心15 min，收集血管組織上清液，采用二喹啉甲酸法進行血管組織凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax)和自噬相關蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62)濃度定量測定；③按照每孔上樣量為40 μg進行蛋白質凝膠電泳實驗，根據目的蛋白分子量大小以及蛋白marker指示進行切膠，濕轉轉膜操作，并采用封閉液封閉1～2 h，孵育對應一抗(1∶1 000)4 ℃過夜，孵育二抗(1∶5 000)1 h，于搖床搖晃洗膜，吐溫-20磷酸鹽緩沖溶液洗膜2～3次，每次5 min，滴加顯影液顯影并拍照。

1.2.4自噬小體檢測 血管組織包埋、切片，厚度5 μL，經醋酸雙氧鈾和檸檬鉛染色，透射電子顯微鏡觀察血管形態以及自噬小體并對其拍照。

2 結 果

2.1三組大鼠體重、血糖、胰島素水平比較 三組大鼠的體重、血糖、胰島素水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，糖尿病組、MET藥物處理組大鼠的體重、胰島素水平均降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組(P<0.05)；血糖升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組(P<0.01)，見表1。蘇木精-伊紅染色顯示，糖尿病組大鼠的血管內膜排列紊亂、內皮粗糙、中膜增厚；MET藥物處理組大鼠血管內皮光滑且排列整體，見圖1。

表1 三組大鼠體重、血糖、胰島素水平比較

圖1 各組大鼠主動脈血管形態變化(蘇木精-伊紅染色，×400)

2.2三組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達的比較 三組大鼠的Bax、Bcl-2蛋白表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，糖尿病組、MET藥物處理組大鼠的Bax蛋白表達水平均升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達水平降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組(P<0.05)。見圖2、表2。

2a：Bax蛋白表達變化；2b：Bcl-2蛋白表達變化

2.3MET對糖尿病血管內皮自噬小體的影響 與對照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組血管內皮自噬小體數量均明顯減少，但MET藥物處理組多于糖尿病組。見圖3。

圖3 各組大鼠電鏡檢測血管內皮自噬小體數量(×10 000)

2.4三組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表達的比較 三組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表達比較

表2 三組大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達的比較

差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平顯著降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組(P<0.05)；p62蛋白表達水平升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組(P<0.05)。見表3、圖4。

LC3：微管相關蛋白1輕鏈3；MET：二甲雙胍4a：LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達變化；4b：p62蛋白表達變化

表3 三組大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白表達的比較

3 討 論

糖尿病血管病變包括大血管和微血管病變，是誘發糖尿病患者致死、致殘的主要原因[9]。血管內皮功能異常是導致糖尿病血管病變的重要因素[10]。近年來隨著糖尿病患者數量急劇增加，糖尿病血管并發癥的發病率亦快速上升。因此，深入研究糖尿病血管內皮損傷的分子機制、尋求有效的靶向藥物防治策略已成為醫學界的研究熱點。

MET是一種經典的口服降糖藥物，具有減少糖尿病誘發心血管疾病發生、保護心血管系統的作用。既往研究證實，MET具有抗炎、降低血壓、降血脂、改善胰島素抵抗、抑制動脈粥樣硬化等作用[11-12]。但目前有關MET對糖尿病誘導的血管內皮損傷的具體分子機制尚不清楚。細胞凋亡是一種主動的程序性細胞死亡方式，是糖尿病血管內皮損傷的重要原因。本研究結果顯示，與對照組比較，糖尿病組大鼠的血糖升高、體重和血漿胰島素水平顯著降低，表明糖尿病大鼠造模成功；而MET藥物處理組大鼠的體重、胰島素水平高于糖尿病組，血糖低于糖尿病組，表明MET對糖尿病具有一定的治療效果。血管內皮細胞凋亡是內皮損傷的重要因素，其中Bax和Bcl-2是細胞凋亡的兩個關鍵性蛋白。本研究中，與對照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組大鼠的Bax蛋白表達均顯著上調，Bcl-2蛋白表達均顯著下調，但MET藥物處理組的Bax蛋白表達水平低于糖尿病組，Bcl-2蛋白表達水平高于糖尿病組，表明MET能夠抑制高血糖誘導的主動脈血管內皮Bax表達上調，Bcl-2表達下調，改善血管內皮功能。提示MET可通過調控Bax和Bcl-2蛋白表達，抑制血管內皮凋亡，改善糖尿病血管內皮損傷。以往研究證實，MET能夠通過下調胱天蛋白酶3、Bax，上調Bcl-2而抑制糖尿病心肌病和糖尿病腎病大鼠心肌細胞和腎小管上皮細胞凋亡[13-14]。但是有關MET對糖尿尿病血管內皮細胞凋亡的調控機制尚不完全清楚。

細胞自噬是一種新的調控細胞死亡的方式，按照分子機制可分為巨自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬。研究表明，自噬與糖尿病心血管病變的發生、發展有關[5，15]。但是不同的誘因和刺激強度會激活不同類型細胞自噬性的保護或損傷作用。高糖(25 mmol/L)處理心肌微血管內皮細胞可抑制細胞自噬水平，誘導心肌微血管內皮細胞凋亡[16]。在高糖(33 mmol/L)處理臍靜脈內皮細胞24、48 h后，免疫印跡檢測顯示內皮細胞的Bax表達增加，自噬水平降低；而通過誘導自噬可以降低Bax表達，緩解高糖誘導人臍靜脈內皮細胞凋亡[17]。相反，在高糖處理的心肌細胞H9c2中培養細胞48 h后，細胞自噬水平升高，凋亡增加，而通過抑制自噬可減少H9c2細胞的凋亡[13]。上述研究提示，自噬不僅可維持血管內環境穩態，還可參與血管內各種細胞生長和死亡的調控。因此，深入探討自噬對血管內皮細胞的作用及調節機制意義重大。研究發現，在C57BL/6小鼠大腦中動脈阻塞模型中，MET預處理能夠促進自噬形成，改善神經損傷[18]；在2型糖尿病腎病大鼠模型中，MET通過誘導細胞自噬，改善糖尿病大鼠腎臟損傷[19-20]。這表明，MET可通過促進自噬發揮多種誘因導致的心腦血管損傷[21]。本研究結果顯示，與對照組比較，糖尿病組和MET藥物處理組大鼠的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平顯著降低，但MET藥物處理組高于糖尿病組；p62蛋白表達水平升高，但MET藥物處理組低于糖尿病組，表明MET可以誘導細胞自噬，改善血管內皮損傷。李冰玉等[22]研究表明，MET能夠調控轉化生長因子-β1誘導的血管內皮細胞自噬，從而發揮血管保護作用。另外，MET也可以通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號，誘導細胞自噬，從而促進垂體泌乳素瘤細胞凋亡[23]。本研究結果與上述研究結果一致。

綜上所述，MET可降低糖尿病血管內皮損傷，其機制可能通過誘導內皮細胞自噬進而抑制血管內皮細胞凋亡。以上研究結果初步揭示了MET對糖尿病大鼠血管內皮損傷的保護作用機制，為MET用于治療糖尿病血管病變提供了新的可能。