食管鱗狀細胞癌患者外周血中Tfh細胞相關因子的表達及臨床意義

郝 賀，楊春旺，曹 靜，郭曉金，李 幸，汪治宇

(河北醫科大學第四醫院腫瘤免疫科，河北 石家莊 050011)

食管癌(esophageal cancer, EC)是臨床常見的惡性腫瘤之一, 進行性吞咽困難為典型癥狀。食管癌患者行腫瘤病灶切除仍是可切除食管癌的有效治療方法，然而術后患者局部復發或遠處轉移率高達40%～60%，是導致食管癌患者病死率的主要原因。腫瘤炎性微環境可以促進腫瘤的增殖、遷移、轉移和血管生成[1]。濾泡輔助性T細胞( T follicular helper cell，Tfh) 屬于CD4+T細胞亞群，是腫瘤間質浸潤性炎性細胞的重要組成部分[2]。Tfh細胞表達CXC趨化因子受體5(CXC chemokine receptor type 5, CXCR5)、趨化因子(CXC基元)配體13(CXC chemokine ligand 13,CXCL-13)、程序性細胞死亡1(programmed cell death-1，PD-1)等表面分子, 并且分泌白細胞介素21( interleukin-21，IL-21)，在B細胞的分化成熟、分泌高親和力抗體及建立長期體液免疫等過程中扮演重要角色。研究發現，Tfh細胞參與了免疫風濕性疾病，過敏性疾病及免疫缺陷型疾病的發生發展過程[3-6]，近年來，眾多學者開始探索其在腫瘤領域的應用,尤其是在腫瘤炎性微環境中的功能。目前Tfh細胞在食管癌領域的研究尚不夠深入，通過對Tfh細胞及相關因子的研究，可以增進對食管癌炎性微環境及免疫逃逸機制的認識，并為食管癌早期診斷及復發監測提供依據。前期研究發現，食管鱗狀細胞癌患者血清中Tfh細胞相關因子PD-1水平較正常人增高[7-8]。本研究采用酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)方法，收集初診收治的食管鱗狀細胞癌患者及同時期的健康人作為研究樣本，通過對比分析食管鱗狀細胞癌患者及健康人對照組外周血中Tfh細胞相關分子可溶性CXCR5(soluble CXCR5，sCXCR5)、可溶性CXCL-13(soluble CXCL-13,sCXCL-13)及IL-21的表達水平，并結合臨床病理特征及手術干預分析其對sCXCR5、sCXCL13及IL-21的影響，探討Tfh細胞相關因子在食管鱗狀細胞癌疾病發病機制上的意義。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取我院2016年6月—2017年4月收治的原發性食管鱗狀細胞癌患者65例，男性48例，女性17例。入選標準：①經組織病理檢查確診為食管鱗狀細胞癌的患者；②未接受化放療及免疫靶向治療者；③無免疫系統疾病及嚴重感染或器官功能受損的病例者，收集同期我院體檢中心性別和年齡相匹配的30名健康體檢者為對照組，其中男性20例，女性10例，年齡53～72歲。

本研究經醫院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 人sCXCR5、sCXCL13及IL-21 ELISA試劑盒。

1.3方法

1.3.1標本的收集及處理 普通促凝真空管收集食管鱗狀細胞癌患者及正常對照組清晨空腹血5 mL，手術患者術后第5天繼續采血5 mL。室溫靜置30 min,離心后取上清液置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3.2血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21檢測 ELISA法檢測患者及正常對照組血清sCXCR5、sCXCL13及IL-21的含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4統計學方法 應用SPSS 24.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢檢；不同病理特征組之間表達差異采用χ2檢驗；sCXCR5、sCXCL13及IL-21相關性分析采用Spearman方法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1食管鱗狀細胞癌組與正常對照組血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達水平 食管鱗狀細胞癌組血清sCXCR5、sCXCL13及IL-21水平高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 食管鱗狀細胞癌實驗組與健康人對照組血清中sCXCR5,sCXCL13及IL-21表達水平比較Table 1 Levels of circulating serum sCXCR5, sCXCL13 and IL-21 between ESCC and healthy group

2.2食管鱗狀細胞癌組手術前后血清中sCXCR5,sCXCL13及IL-21表達水平 食管鱗狀細胞癌組手術前后血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 食管鱗狀細胞癌組手術前后患者血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達水平比較Table 2 Levels of circulating serum sCXCR5,sCXCL13 IL-21 before and after operation in ESCC group

2.3食管鱗狀細胞癌組血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達水平與臨床病理特征的關系 血清中sCXCL13和IL-21的表達水平與臨床病理特征無明顯相關(P>0.05)，sCXCR5的表達水平腫瘤體積大小相關(P<0.05)。見表3。

表3 食管鱗狀細胞癌組患者血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21在不同病理特征組之間表達的比較Table 3 Comparison of the expression of sCXCR5,sCXCL13 and IL-21 in the serum of patients with esophageal squamous cell carcinoma between groups with different pathological characteristics

2.4食管鱗狀細胞癌組血清中sCXCR5,sCXCL13及IL-21相關性分析 食管鱗狀細胞癌患者外周血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21所得數據呈非正態分布，故行Spearman相關性分析,結果所示，sCXCR5與sCXCL13無相關性(r=-0.152,P>0.05)；sCXCR5與IL-21無相關性(r=0.112,P>0.05)；IL-12與sCXCL13無相關性(r=0.263,P>0.05)。

3 討 論

最新的研究數據表明，食管癌在世界常見惡性腫瘤排名中位于第8位，其病死率居第6位[9]。我國屬于食管癌高發國家，其發病率在惡性腫瘤中約為第6位，病死率居第4位。食管鱗狀細胞癌為最主要組織病理學類型，其百分比占食管癌發病率的90%以上[10-11]。目前食管癌的治療方式主要為手術、內鏡切除及放化療，但預后仍然較差，病死率未得到根本改善。加深對食管癌免疫逃逸機制的探索，深入開展食管癌免疫微環境的基礎研究，成為食管癌治療的當務之急。與胃腸道腫瘤研究類似，食管癌分子機制的主要研究集中在腫瘤細胞本身，即致癌基因的活化(如cyclin D1和EGFR)和抑癌基因的失活(如TP53，p120catenin，E-鈣黏蛋白)[12-14]。但是，越來越多的證據表明，腫瘤細胞所處的微環境也是食管癌發生的必要因素。這些外環境中包括免疫細胞、活性成纖維細胞、脂肪細胞、細胞外基質、內皮細胞、血管周細胞、神經元等，這些因素構成了腫瘤賴以生存的微環境。腫瘤微環境在抑制腫瘤細胞凋亡，誘導免疫逃避，促進腫瘤細胞增殖，血管生成，侵襲和轉移等方面起到了一定促進作用[15-16]。

Tfh細胞是輔助性CD4+T細亞群，屬于腫瘤微環境中免疫細胞的重要組成部分，能持續分泌CXCR5，后者與趨化因子CXCL13結合后使Tfh細胞遷移至濾泡區參與生發中心的形成。在可誘導共刺激分子(inducible T cell co-stimulator，ICOS)與CD40L共同作用下，Tfh細胞分泌效應因子IL-21發揮重要的免疫作用。Tfh細胞不僅與自身免疫性疾病、感染性疾病及免疫缺陷型疾病相關，目前越來越多的學者也開始探索其在腫瘤領域的應用。研究表明，在淋巴系統腫瘤中，浸潤性的Tfh細胞與較差的預后相關，然而在非淋巴系統腫瘤中Tfh細胞與較好的預后相關[17-19]。

已有研究表明，Tfh細胞趨化因子CXCR5及其配體CXCL13在腫瘤細胞的增殖及發展中具有重要影響。Qi等[20]研究發現，在結直腸癌晚期患者中，CXCR5及CXCL13的表達水平與結直腸腫瘤的遠處轉移、TNM分期、分化程度、神經浸潤等因素密切相關。Duan等[21]研究指出肝細胞癌患者血清中游離的CXCL13上升，與肝癌術后的復發率存在一定相關性。Ohandjo等[22]研究表明，CXCR5及CXCL13的表達水平與前列腺癌患者病情嚴重程度呈正相關性。Stolfi等[23]研究表明，IL-21可增強炎性微環境并促進了結腸炎相關結腸癌的發展，阻斷IL-21可能會降低結腸炎相關結腸癌的發病風險。本研究結果發現，食管鱗狀細胞癌組血清中sCXCR5、sCXCL13、IL-21水平較正常對照組增高，這與上述學者的研究觀點大致相同。同時，發現食管癌術后患者，血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21未發生明顯改變，這可能與患者術后第5天機體仍依然處于應激有關。針對食管鱗狀細胞患者的臨床病理特征與sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達水平相關性分析，發現血清中sCXCR5表達水平與食管鱗狀細胞患者的腫瘤體積大小相關，提示sCXCR5表達水平與腫瘤負荷情況有一定相關性。

本研究還有許多不足：只監測了患者術后第5天外周血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達情況，應進一步延長監測時間，了解患者免疫狀態，觀察與患者病情變化的關系；檢測食管鱗狀細胞癌患者組織中sCXCR5、sCXCL13及IL-21的水平，追蹤觀察患者的生存期，明確是否與外周血清中sCXCR5、sCXCL13及IL-21表達有相關性，可否作為預后指標；增加檢測手段進行論證，如流式細胞術、Western蛋白水平及PCR基因水平的檢測。

近年來，濾泡調節性T細胞(T follicular regulatory cell，Tfr)在自身免疫性疾病與腫瘤的研究中成為熱點。Tfr細胞屬于Treg細胞亞型，來源于天然Treg細胞。Tfr細胞不僅可以表達Treg細胞相關的抑制性調節因子，還具有Tfh細胞的特性，可表達CXCR5、ICOS等因子。在功能方面，Tfr細胞通過抑制Tfh和B細胞來特異性地控制生發中心的應答[24]。研究表明，Tfh與Tfr在非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、淋巴瘤等癌種的疾病進展中發揮重要作用[25-28]。相信通過對食管鱗狀細胞癌中Tfh與Tfr的深入研究，可以加深對食管鱗狀細胞癌炎性微環境的理解，為食管鱗狀細胞癌的治療提供新的方向。