銅基納米顆粒在農藥領域的潛在應用

董欣欣, 姬彥飛, 田 野, 張 杰, 劉成偉

(東北林業大學 生命科學學院，東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

0 銅基納米顆粒概述

銅 (Cu) 是一種具有優良傳導性與延展性的金屬，在工業上有著極為廣泛的應用。近年來，納米顆粒 (nanoparticles，NPs) 因其獨特的性能而越來越受到人們重視，銅基納米顆粒更是較為廣泛應用的納米金屬材料。

與傳統銅劑相比，銅基納米顆粒具有體積小、比表面積大、活化能高、活性位點多等諸多優良的獨特性能，使得其在許多領域都有著極為廣泛的應用潛力[1]。銅基納米顆?？捎米髂承┓磻拇呋瘎?，由于納米粒子的比表面積較大，因而與傳統銅金屬材料相比能取得更好的催化效果[2]。銅基納米顆粒具備一定的熒光性能，在與某些特定物質接觸后可特異性地發生熒光猝滅，因而可利用該熒光特性進行某些物質的檢測或環境監測[3]。銅基納米顆粒的熒光特性還可用于生物探針的制備，將其與特定序列的DNA 模板等生物材料相結合，制備成新型生物熒光探針或檢測材料，可對特定序列進行標記，從而通過熒光的有無及強弱對生物材料進行原位標記與含量測算[4]。此外，銅基納米顆粒因其獨特的理化性質與生理毒性，在農藥學領域也有著廣泛的應用潛力[5]。

銅劑在農藥領域的應用由來已久。銅離子可以抑制細菌與真菌的生長，含銅農藥也已成為農業上應用廣泛的抑菌劑之一[6]。常見的含銅農藥有波爾多液 (bordeaux mixture)、氧氯化銅 (copper oxychloride)、氧化亞銅 (cuprous oxide)、噻菌銅(thiediazole copper)、松脂酸銅 (resin acid copper salt) 及喹啉銅 (copper 8-quinolinolate) 等，總體可分為無機銅農藥與有機銅農藥[7-8]。在農業生產實踐中，傳統含銅農藥因具有一些難以避免的缺陷(如無機銅劑易變性及產生藥害，有機銅劑對人畜具有較高的毒性與危險性等)，且長期以來農藥的使用造成了大量耐藥菌的出現，因而急需開展新型農藥制劑的研究開發[9]。

與傳統銅制劑相比，銅基納米顆粒具有完全不同的作用機制[10]，因而適用于更廣泛的應用場景，可考慮用于植物生長調節劑、抑菌劑及除草劑等諸多方面。

1 銅基納米顆粒作用機理

1.1 營養補足

銅元素在植物中普遍存在，是植物生存必不可少的微量元素之一[11]。銅元素參與了植物中多種氧化還原酶類的構成，這些酶類與植物的正常代謝及抗逆性能息息相關。在諸如抗壞血酸氧化酶、漆酶等的銅氧化酶結構中，銅離子起著活性中心的作用。在酶促反應中，電子可由底物傳遞至銅離子中心發生氧化還原反應，最終生成水分子。植物的多種生命活動與代謝途徑都離不開含銅酶類的參與，含銅酶類在植物的愈傷、發育及生殖等進程中均扮演著重要的角色[12]。當銅元素缺乏時，植物的各項生理活動進程均可被阻滯，并可發生葉片萎黃、木質發育不良等狀況，甚至可能導致植株生長阻滯或死亡[13]。

Nasrollahzadeh 等[14]報道，施用金屬納米顆?？梢杂行岣咧参镏袑氐暮?。將銅基納米顆粒制成懸液進行噴施，可以起到補足植物所缺銅素的作用。納米顆?？山浻芍参锔导叭~片氣孔等進入植物體內，并通過各種轉運機制運抵植物全株[15]。

1.2 氧化應激與膜崩解

經較高濃度的銅劑處理后，生物體內會迅速形成大量自由基，當所產生自由基的量超出細胞內抗氧化物的平衡能力時，就會導致細胞產生各種氧化損傷[16]。圖1 展示了銅基納米顆粒對植物病原菌 (以真菌為例) 的損傷作用。

Chatterjee 等[17]指出，由銅基納米顆粒介導的細胞膜電位耗散與大量活性氧等自由基對膜脂及細胞成分的破壞可能是其主要的毒性作用機理。在納米顆粒誘導下，細胞內膜結構的跨膜質子動力被阻斷，造成膜電位顯著下降，并由此造成細胞骨架蛋白分布的改變，導致膜通透性改變與功能喪失，甚至崩解。Banik 等[18]在其研究中也發現，銅基納米顆粒會造成胞內氧化狀態的失衡，由于細胞內酚類物質、脯氨酸、谷胱甘肽等不足以調控其氧化水平，導致大量膜脂及蛋白被破壞形成丙二醛等小分子物質，使得細胞膜出現崩解及滲漏，從而引起內容物流出。

Wang 等[19]解析了銅劑處理后細胞代謝物成分的變化，發現胞內磷脂酰乙醇胺及磷脂酰膽堿等物質的量明顯減少，而磷脂酰甘油和單半乳糖基二?；视偷任镔|的量則顯著增加，這些物質的變化可能與胞內的膜脂過氧化有關。此外，氧化應激還會引起胞內谷胱甘肽代謝紊亂及滲透調節因子積累異常等。

銅基納米顆?？赡芡ㄟ^擴散內化或經由細胞的內吞作用進入胞內，并在納米顆粒表面或胞內溶解的銅離子附近產生活性氧[20]。納米顆?？赏ㄟ^導致胞內抗氧化酶失活而造成大量內源性過氧化氫釋放，也可通過阻斷線粒體電子傳遞鏈而產生大量超氧化物[21]。胞內活性氧的產生不僅會對細胞膜造成氧化損傷，還會對核內DNA 分子及相關蛋白造成不可逆破壞[22]，從而致使細胞生長阻滯或死亡。此外有研究表明，即便在活性氧生成較少的情況下，納米顆粒仍可通過與特定膜結構及特定蛋白的結合來阻礙基因表達，造成細胞某些基因表達量的顯著下調，從而嚴重干預細胞的各項代謝水平與生理功能[23]。

1.3 誘導系統抗性

誘導性系統抗性 (induced systemic resistance，ISR) 是植物在受到環境脅迫或遭受侵染性病害時產生的一系列防御機制，經由一些特定基因的激活與代謝途徑的產生，總體表現為抗氧化酶活性或非酶類抗氧化劑含量等的升高[24]。

銅基納米顆粒的施用，可“模擬”真實病害或逆境脅迫時的氧化損傷，從而激發植物的誘導性系統抗性，因而可提升植物的抗逆能力及活性成分含量[25]。植物的系統抗性主要表現為特定抗性基因表達量的顯著提升，從而引發特定抗氧化酶活性提高，以及非酶抗氧化劑及角質、蠟質、類黃酮等次生代謝產物含量的增長[26]，而這些變化都與植物的抗病能力息息相關，也將顯著提高植物對環境脅迫的應對能力。

2 銅基納米顆粒應用類型

2.1 用作植物生長調節劑

金屬納米顆粒對植物的影響與植物品種及納米顆粒形態、濃度、施用方式等因素均有關系[27]。在合理的施用條件下，銅基納米顆?？娠@著增加植物的礦質營養，并促進植物生長、提高果實品質[28]。根據這些性質，可將銅基納米顆粒用作植物生長調節劑。

Hafeez 等[29]采用納米銅 (Cu NPs) 懸液處理小麥，發現小麥干重等生長參數明顯增加，并檢測到了葉綠素含量的升高。Hernández-Hernández 等[30]的研究證明了納米銅與納米硒在適宜濃度與配比時對番茄果實產量增加與品質提升的作用，并發現葉片與果實中的抗氧化物質含量也均有不同程度升高，而該指標標志著番茄植株的抗病性能有所增強；此外，噴施適宜濃度與配比的納米銅和納米硒后，番茄果實中的抗壞血酸、谷胱甘肽及類黃酮等活性物質的含量也均高于對照組。Choudhary等[31]將銅基納米顆粒與殼聚糖制成混合營養劑，用于玉米植株上噴霧施用，不僅提高了玉米的生長參數，還提升了玉米植株對彎孢菌葉斑病的抵御能力。

Zhao 等[32]在其研究中證實，銅基納米顆粒噴施后可被植物根部直接吸收，經由一個由含硫蛋白構成的轉運結構傳輸至葉片等各個部位，并可在相關酶的作用下將銅基納米顆粒轉化為銅鹽加以吸收利用。將銅基納米顆粒作為藥物載體與其他營養補充劑結合，不僅可誘導植物的系統抗性，還可為其提供營養補充，從而起到更好地調節植物生長的作用[33]。

2.2 用作抑菌劑

銅基納米顆?？梢鸺毎难趸瘬p傷，并可介導膜崩解，因而可用于植物病原菌的防控，在農業中作為殺菌劑加以利用。近年來將銅基納米顆粒用作殺菌劑防控植物病害的相關研究見表1。

表1 采用銅基納米顆粒抑制植物病原菌的相關研究Table1 Research on inhibition of plant disease pathogens using copper-based nanoparticles

從表1 中數據可看出，不同類型銅基納米顆粒的抗菌活性存在較大差異。Hermida-Montero等[34]曾指出，銅基納米顆粒的抑菌活性與其晶格、合成路線及粒徑等諸多因素有關，同時他們還認為，納米顆粒的流體力學尺寸可能也與其生物活性等密切相關。流體力學尺寸影響著銅基納米顆粒與水環境或胞質溶膠的實際接觸面積，因而影響著實際釋出銅離子的量以及最終可產生自由基的量，而這些因素均與銅基納米顆粒的抑菌性能密切相關。銅基納米顆粒的抑菌作用不依賴代謝通路，因而具有廣譜性，在多種病原菌的防治中均具有較好的應用前景[35-36]。

此外也有研究嘗試將銅基納米顆粒與農業生產中的某些抗菌藥物聯用，探究其聯用對防治效果的影響。結果表明，添加銅基納米顆粒可顯著提高抗真菌藥物的效果，從而減少傳統化學藥劑的使用，降低對環境的污染，同時可取得更好的防效，對農業生產中植物病蟲害的防治具有積極意義[37]。Malandrakis 等[41]將納米銅顆粒與甲基硫菌靈 (thiophanate-methyl)、氟啶胺 (fluazinam)等傳統抗真菌藥劑聯用，對15 種耐藥性灰葡萄孢Botrytis cinerea 進行抑菌活性試驗。結果表明，納米銅顆粒極大地提升了傳統抗真菌藥劑的抑菌活性，將其與推薦劑量1/50 的甲基硫菌靈聯用，仍可保證較好的殺菌效果。此外，作者進一步研究發現，大量耐多種藥劑的灰葡萄孢菌株的耐藥性與其線粒體cytb 基因的G143A 抗性突變有關，該位點的突變使得經由三磷酸腺苷 (ATP) 代謝途徑發揮抗菌效果的殺菌劑紛紛失效，而添加納米銅顆粒后則可對這些耐藥菌產生良好的殺滅效果，因而推測納米銅顆粒的殺菌效果可能與破壞植物病原菌的ATP 代謝通路有關。銅基納米顆粒被菌體吸收后雖然會破壞菌體的生理結構，但卻會增強其轉運系統，從而使得銅在菌體結構間的轉移性能得到增強，有利于高效發揮銅基納米顆粒的抑菌作用[42]。此外有研究證實，在低于最小抑菌濃度下，銅基納米顆粒仍可通過破壞真菌的菌絲結構而減少甚至完全阻止真菌毒素的產生，這在農業生產與農產品存儲方面具有十分重要的價值，值得研究者注意[39]。真菌毒素是難以消除的小分子有機物，對人畜具有廣譜的致癌作用，是農產品儲存的一大難題，若能將銅基納米顆粒制成能夠有效抑制真菌毒素產生的抑菌劑型，將極大地提高倉儲農產品的安全性。

此外，銅基納米顆粒對植物上的細菌性病害也有一定的防治能力。已有研究證實，銅基納米顆粒對植物軟腐病[43]、葉枯病[44]、青枯病[45]及斑點病[46]等侵染性細菌病害均有較好的防治效果。氧化應激與活性氧的產生也是銅基納米顆粒對細菌細胞造成殺傷效果的主要機制[38]。銅基納米顆粒對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌均具有較好的殺滅能力，在進入胞內后可顯著抑制其抗氧化酶的活性，并對細菌質膜的穩定性構成威脅[47]。Shuai 等[48]的研究也證實，納米顆粒具有損傷細菌細胞膜結構及改變其通透性的能力。Noman等[49]在其研究中進一步發現，銅基納米顆粒不僅會破壞細菌細胞膜的結構，還可對其細胞壁結構造成不可逆損傷：銅基納米顆粒可通過產生活性氧等自由基破壞細胞壁成分中各官能團的C–C 鍵，造成細胞壁上碳水化合物與氨基等結構的降解，從而導致菌體生理功能喪失與細胞成活力降低，并最終導致菌體死亡。

銅基納米顆粒雖然具有良好的抗菌活性，但其可能帶來的環境污染問題也在一定程度上制約了其應用和發展。由于銅基納米顆粒對環境的危害程度與其成分、濃度、粒徑以及表面有無包覆劑等因素相關，因而可以通過包埋、交聯等手段改變其組成或表面結構，從而減少潛在危害，提高其生物利用率[50]。Halbus 等[51]采用三甲氧基硅烷和4-羥基苯基硼酸對氧化銅納米顆粒進行交聯，從而顯著增強了氧化銅納米顆粒對植物病原菌的損傷能力，降低了使用濃度，提高了抑菌效率并可減輕對環境的威脅。這是由于交聯后所形成的復合物表面的硼酸基團可與細菌表面的糖蛋白共價結合，從而有效提高了其對病原菌細胞的親和力。此外，殼聚糖[52]、檸檬酸三鈉[53]等均可用于銅基納米顆粒的包埋。經過包埋等方式處理后，納米顆粒對病原菌細胞的滲透能力顯著提升，其抗菌能力也隨之增強，同時對植物造成損傷的可能性隨之減弱。

2.3 用作除草劑

金屬納米顆粒對植物細胞結構也具有一定的破壞作用[54]。與眾多其他重金屬微量元素一樣，在濃度較高時，過量的銅元素會對植物造成嚴重損傷[55]。高濃度的銅離子會對植物細胞中的膜結構造成損傷，改變膜蛋白活性與膜的通透性，造成膜功能喪失，使得依賴于膜功能的光合作用等特定代謝途徑發生異常，進而導致植株營養積累阻礙[56]。

銅元素在植物中參與了部分特定氧化還原酶類及某些光合色素的合成，因而過量的銅被植物吸收后，會經由PAA1、HMA6 等銅轉運蛋白定向轉移至葉綠體中[57]，并會首先在葉綠體處產生大量的活性氧自由基，從而導致葉綠體產生氧化損傷 (圖2)。針對此特性，可采用銅基納米顆粒制備新型除草劑，用以消除雜草等特定植物，或清除水域中的藻類污染。

銅基納米顆粒對植物綠色細胞的損害類型主要是氧化損傷。被植物吸收的銅基納米顆粒能轉化為多種離子形態，在植物細胞各個部位特別是膜結構附近產生大量自由基，對植物的代謝及光合作用等產生強烈的抑制作用，阻礙某些代謝中間體的積累，降低植物的呼吸速率，從而抑制植物生長，甚至造成植株死亡[58]。Adhikari 等[59]的研究表明，過量攝入的Cu2+會取代葉綠素光反應中心的Mg2+，從而損害光合反應的正常進行，此外銅基納米顆粒還會抑制類胡蘿卜素的形成，進一步損傷細胞的抗氧化能力，使得其更易受到納米顆粒的損害。

目前已有研究者利用銅基納米顆粒對某些植物的特定毒理作用而將其用作除草劑，用于清除田間雜草或造成水域污染的浮游植物。傅鳳等[60]研究了納米銅顆粒對4 種常見水生藻類的抑制活性，發現其在較低質量濃度 (2.0 mg/L) 下即可顯著抑制4 種水生微藻的生長，因而可作為治理水華的理想藥劑。Müller 等[61]采用納米銅顆粒處理萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii，取得了較好的殺滅效果，并認為其對該單細胞藻類的殺滅作用主要經由Cu2+的釋放而實現。Perreault 等[62]采用聚合物包覆的氧化銅納米顆粒抑制萊茵衣藻的生長，與無包覆的氧化銅納米顆粒相比取得了更好的效果。此外，氧化銅納米顆粒還可通過強烈的膜崩解作用而對水體中的蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosa 起到殺傷作用[63]。因而可將銅基納米顆粒用于湖面等密閉水域污染的治理，可有效抑制浮游植物的生長[64]，從而遏制水華等水域污染現象，有利于良好水域生態的建立[65]。

3 展望

銅不僅是植物生長必不可少的重要微量元素，同時也是極易造成環境污染的重金屬元素之一。銅基納米顆粒所具有的諸多獨特性質，使得其在農藥領域具備了廣闊的應用前景。目前銅基納米顆粒的制備方法大致可分為化學法與生物法?；瘜W法總體又可分為固相法、液相法和氣相法等，其中液相法具有易操作、工藝流程短及工業化生產成本低等優勢，是目前主要的工業生產方法[66]。近年來銅基納米顆粒的生物合成已越來越受到矚目，現有研究證實，包括細菌、真菌、藻類、植物等在內的多種生物系統均可用于銅基納米顆粒的合成。與化學合成相比，銅基納米顆粒的生物合成方法具有污染低、產物生物相容性好等特點，在實際應用中具備一定的獨特優勢[67]。采用生物法合成的納米顆粒外表通常被有機物包覆，這些有機物質的存在對其生物相容性起著決定性的作用，同時還可起到緩釋銅離子的作用。此外，與化學法相比，生物法合成的銅基納米顆粒具有更好的分散性能與熱穩定性[68]，這對于其實際應用效果極為關鍵。

少劑量的銅劑可以有效提高植物的銅素營養，并可從多種途徑增進植物的代謝速率。此外，由適量銅劑刺激引發的誘導性系統抗性也是植物抗逆性能的關鍵。這些機制都有利于提高植物的營養吸收、生長參數以及對不良環境條件的耐受能力。目前將銅基納米顆粒用作植物生長調節劑時常需與傳統營養劑搭配使用，從而提高植物的銅耐受能力，并起到促進植物生長的效果。此外，可以采用包埋等方法處理銅基納米材料以實現緩釋效果，從而在發揮銅劑植物生長調節劑功能的同時避免其快速攝入而對植株造成損害。

銅基納米顆粒對植物病害病原菌可起到良好的抑制或殺滅作用，其主要作用機理是所引發的氧化應激與膜崩解作用[69]，此外其所誘發的活性氧生成與胞內氧化應激反應的產生也是其毒理特性的重要因素之一[70]。這些活性氧的生成不僅會對細胞結構造成破壞，還會導致DNA 降解，對細胞的遺傳物質與遺傳結構造成不可逆損傷[71]。銅基納米顆粒在抑菌方面具備較好的應用潛力，其與傳統農藥抑菌機理不同，有可能取得更為優異的抑菌效果，并可減少化學農藥生產及使用過程中可能產生的環境污染。考慮到銅基納米顆粒對植物的毒害作用與可能引發的銅素富集問題，當前一般將其與傳統抑菌農藥共同使用而非單獨施用。在與傳統農藥共同使用時，銅基納米顆?？梢燥@著提高傳統農藥的防治效果，并可對傳統農藥難以殺滅的耐藥菌產生較好的防治效果[41]?？紤]到銅基納米顆粒的毒性，在制備時可采用包埋技術以實現緩釋效果，并應考慮植株的耐銅能力選用不同的施用方式，以避免對植株產生藥害。

銅基納米顆粒的抑菌效果及對環境的影響與其成分、粒徑和表面結構等息息相關。目前廣受矚目的研究方向是如何盡可能縮小銅基納米顆粒的尺寸以提高藥效，并使用包埋等技術手段減輕其對環境的威脅。以往研究中通常使用殼聚糖等物質進行包覆，或采用生物法進行合成。近年來使用金屬有機框架 (metal-organic frameworks，MOFs) 進行農藥負載的研究已逐漸成為熱點，與傳統載體相比，MOFs 具有吸附能力強、孔徑可調等特點[72]，在農藥負載方面具有較好的應用前景[73]。而銅基MOFs 本身便具有一定的抑菌能力[74]，因而在用于農藥負載時有望對藥效起到增強作用。有研究指出，根際有益微生物的存在可以通過多種機制提高植物的銅耐受能力[75-76]，因此在實際應用中可將銅基納米顆粒與有機菌劑復合施用。

利用銅基納米材料的毒理學作用可以實現植被的清理與水域的凈化?，F有研究證實，銅基納米顆粒對植物組織的毒性作用具有種屬特異性，即不同種植物對銅劑的耐受能力不同[77]，因而可通過相關毒理學試驗，探索能夠有效殺滅雜草并盡可能減少對作物造成藥害的最佳濃度，從而制成與傳統除草劑相比環境危害較小的新型無機廣譜除草劑。此外，水華、赤潮是嚴重威脅水產養殖業的生態災害，具有發展迅速、難以預測等特點，往往會對水產業造成嚴重損失。研究表明，銅基納米顆粒在較低濃度時即可有效殺滅水域中的浮游藻類，這為水華、赤潮的防治提供了一個新的有效解決方案[78]。當然，銅劑本身的潛在環境毒性也是一個不容忽視的問題。銅元素的大量存在會改變環境中各種生物的生理狀態，并可造成植株營養成分流失、活性產物減少等問題[79-80]。銅素污染不僅會對噴施地的生態造成威脅，還會滲入地下水、匯入河流甚至海洋，從而對更廣闊區域的生態造成潛在毒性[81]。因而，如何在環境中安全高效地使用銅劑，仍是一個值得深入研究的問題。

總之，銅基納米顆粒是工業上較常制備與應用的金屬納米材料，因其特殊的理化性質與毒理特征，可在農藥領域得到廣泛開發應用。如用于提高植物的抗病能力，促進營養吸收，減少各種生物災害對農業生產的影響，從而有效提高農作物產量。而利用其廣譜抑菌特性，則可有效減少傳統化學農藥的使用，在取得良好抑菌效果的同時減輕化學農藥生產和使用過程中對自然生態環境的破壞。由于納米金屬材料固有的生理毒性，其在農業生產中的應用仍存在一些問題，但隨著相關機制的闡明與劑型的改進，相信銅基納米顆粒一定可以為新型農業、環保農業的發展中成功助力。