杠柳新苷類化合物對東方黏蟲的殺蟲活性及對中腸細胞刷狀緣膜囊泡3 種特征酶活性的影響

馮明星, 胡兆農*,,,3, 吳文君

(1. 西北農林科技大學 植物保護學院，陜西 楊凌 712100；2. 陜西省植物源農藥研究與開發重點實驗室，陜西 楊凌712100；3. 農業農村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

21 世紀以來，開發具有高效、低毒、安全系數高、選擇性和環境相容性好的新農藥已成為農藥研發的主要目標，而利用靶標酶設計綠色環保農藥已成為農藥開發的重要領域[1]。迄今，研究發現作用于昆蟲中腸的殺蟲活性物質有蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis (Bt) 毒素蛋白和殺蟲植物苦皮藤 Celastrus angulatus 中的苦皮藤素。Bt 作用昆蟲中腸腸壁細胞膜上的靶標主要有氨肽酶[2]、堿性磷酸酶[3]、肌動蛋白[4]及一些糖脂[5]，其中氨肽酶和堿性磷酸酶普遍被認為是Bt 毒素蛋白結合的初始靶標，這為后期毒素蛋白插入昆蟲中腸細胞膜形成“孔洞”奠定了基礎[6]；而苦皮藤素在昆蟲體內的作用靶標為V-ATP 酶H 亞基[7-9]。

殺蟲植物杠柳Periploca sepium Bunge 為蘿藦科 (Asclepiadaceae) 杠柳屬蔓生性灌木，其根皮中含有一類殺蟲活性成分——杠柳新苷類化合物[10]。前期研究表明，這類化合物主要作用于東方黏蟲Mythimna separata Walker 幼蟲的中腸腸壁細胞[11-14]，推測杠柳新苷類化合物有可能在昆蟲中腸細胞膜上具有類似Bt 毒素蛋白或苦皮藤素的作用靶標[15-16]。此外，根據杠柳新苷類化合物對東方黏蟲的作用癥狀，結合定量差異蛋白組學鑒定的表達差異蛋白功能特性分析，認為V-ATP 酶、氨肽酶、堿性磷酸酶均有可能是杠柳新苷類化合物的疑似作用靶標[17]。本研究在比較6 個杠柳新苷類化合物對3 齡東方黏蟲幼蟲胃毒毒力基礎上，測定了它們對東方黏蟲幼蟲中腸特征酶V-ATP 酶、氨肽酶和堿性磷酸酶的酶比活力的影響，旨在為進一步研究杠柳新苷類化合物可能的作用靶標及其作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 昆蟲 東方黏蟲Mythimna separata Walker幼蟲由西北農林科技大學農藥研究所養蟲室提供，為小麥或玉米葉片人工累代飼養30 代以上的敏感品系，飼養溫度為 (22 ± 1) ℃，相對濕度為60%～70%，光周期為L : D = 16 h : 8 h。

1.1.2 化合物 杠柳新苷A (PSA)、杠柳新苷D(PSD)、杠柳新苷E (PSE)、杠柳新苷F (PSF)、杠柳新苷P (PSP) 和杠柳新苷T (PST)，均由西北農林科技大學農藥研究所從杠柳根皮提取物中分離得到，其化學結構式如圖式1 所示。經高效液相色譜檢測其純度達98%以上。

1.1.3 供試試劑 Bradford 法蛋白定量測定試劑盒 (PA102) 購于北京天根公司；腺苷三磷酸-三羥甲基氨基甲烷 (Tris-ATP)、原釩酸鈉、N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 (HEPES)、碳酸氫鈉、2-嗎啉乙磺酸 (Mes) 和巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1,CAS88899-55-2) (純度 ≥ 95%) 購于Sigma 公司；乙二醇雙 (2-氨基乙基醚) 四乙酸 (EGTA)，購于北京索萊寶科技有限公司；MgSO4等無機試劑為國產分析純，購于廣東光華公司；乙醚為分析純，購于西隴化工；Protease Inhibitor Cocktail (EDTAfree) 購于Roche 公司；Bestatin 購自美國Apexbio 公司；L-亮氨酸-p-硝基苯胺 (Leu-pNA) 購自上海科匯公司。

1.1.4 主要儀器 Sorvall ST16R 冷凍離心機，美國Thermo Scientific 公司；CR22G III 高速冷凍離心機，日本Hitachi 公司；BG25 金屬浴，杭州博日科技有限公司；Infinite M 200 Pro 全波長酶標儀，瑞士TECAN 公司；Seven Easy S20 pH 計，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.1.5 緩沖液的配制

1.1.5.1 東方黏蟲中腸細胞中BBMV 提取純化所用緩沖溶液 Buffer A：300 mmol/L 甘露醇，5 mmol/L EGTA，17 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)；1 mmol/L 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (現用現配)。

Buffer B：150 mmol/L Mannitol，2.5 mmol/L EGTA，8.5 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)；1 mmol/L PMSF (現用現配)。

Buffer C：150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)，1% 3-[(3-膽固醇氨丙基) 二甲基氨基]-1-丙磺酸 (CHAPS)；1 mmol/L PMSF (現用現配)。

Buffer D：24 mmol/L MgCl2。

1.1.5.2 V-ATP 酶活性測定所用緩沖液 Ringer Solution：25 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，3.5 mmol/L KCl，1.8 mmol/L NaHCO3，1.0 mmol/L MgSO4，1.7 mmol/L CaCl2，5 mmol/L葡萄糖，pH = 7.1。

Lysis Buffer-PIC：5 mmol/L Na-HEPES，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L 2-巰基乙醇 (Mercapto EtOH), pH ＝ 7.1。

Lysis Buffer + PIC：5 mmol/L Na-HEPES，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L Mercapto EtOH，PIC(Protease Inhibitor Cocktail)，pH ＝ 7.1。

PO Buffer：160 mmol/L Tris-Mes，pH = 6.9。

MV Buffer：30 mmol/L MgCl2，0.8 mmol/L原釩酸鈉，98 ℃煮沸3 min。

KN Buffer：160 mmol/L KCl，4 mmol/L NaN3(10 × KN：2.6 mg/mL)。

8 mmol/L Tris-ATP：用ddH2O 配制為8 mmol/L，分裝后保存于 -20 ℃。

巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1)：用DMSO稀釋至48 μmol/L (陽性對照藥劑)。

鉬酸鈉溶液：將3 份200 mmol/L 的鉬酸鈉溶液加入到6 份ddH2O 中，然后加入1 份現配的24%硫酸。

孔雀石綠 (Malachite Green)：18.5 mg 孔雀石綠溶于25 mL 1%聚乙烯醇中。

1.1.5.3 氨肽酶活性測定所用緩沖液 反應緩沖液：0.25 mol/L Tris-HCl (pH = 7.8)，26 mol/L NaCl；反應底物：15.96 mg Leu-pNA 溶于1 mL 甲醇 (現配現用)；Bestatin：10 μmol/L Bestatin 溶液 (陽性對照藥劑)。

1.2 試驗方法

1.2.1 杠柳新苷類化合物的殺蟲活性 采用載毒葉片飼喂法[18]測定6 個杠柳新苷類化合物 (PSA、PSD、PSE、PSF、PSP 和PST) 對東方黏蟲幼蟲的胃毒毒力：挑選蛻皮第2 天的3 齡東方黏蟲幼蟲，置于培養皿內饑餓12 h 備用。將待測化合物用丙酮分別配制為供試昆蟲死亡率在10%～90%范圍的系列濃度梯度的溶液。用1 μL微量點滴器將不同濃度的藥液分別涂布于0.5 cm × 0.5 cm 小麥或玉米葉片上，以用等量丙酮涂布的處理作為空白對照。待溶劑揮發后，將其置于24 孔板中，每孔放置1 片載毒葉片及1 頭饑餓處理的3 齡東方黏蟲幼蟲。每處理設置20 頭試蟲，重復3 次。用濕紗布保濕，在22～25 ℃、相對濕度為70%～80% 的養蟲室內飼養。不定時觀察幼蟲中毒癥狀。采用SPSS20.0 軟件 (SPSS Inc., Chicago, USA)統計分析試蟲24 h 死亡結果，并計算LC50值。

1.2.2 東方黏蟲中腸細胞BBMV 的制備和檢測 東方黏蟲中腸細胞BBMV 的制備參照MgCl2沉淀差速離心法[19]。挑選蛻皮第2 天的5 齡東方黏蟲幼蟲，經12 h 饑餓后解剖其中腸。首先，用預冷的質量分數為0.7%的氯化鈉溶液將解剖得到的中腸清洗干凈，經濾紙吸干水分后稱量。將4.5 mL Buffer A 溶液加入500 mg 解剖中腸中，用玻璃勻漿器于冰上進行手動勻漿5 次，每次1 min，兩次間隔1 min。隨后，加入等體積 (4.5 mL) 24 mmol/L的氯化鎂溶液，冰浴15 min 后，于4 ℃、2 500 g下離心15 min，留取上清液 (記為第1 次離心所得) 置于冰上；用4.5 倍體積 (2.25 mL) 的Buffer A 溶液及等體積24 mmol/L 的氯化鎂溶液將離心所得沉淀重懸；再次于4 ℃、2 500 g 下離心15 min，取上清液 (記為第2 次離心所得) 置于冰上；用4.5 倍體積 (2.25 mL) 的Buffer A 及等體積24 mmol/L 的氯化鎂將第2 次離心所得沉淀再次重懸，冰浴15 min，然后于4 ℃、2 500 g 下再次離心15 min，取上清液 (記為第3 次離心所得) 置于冰上。將3 次離心所得的上清液合并，于4 ℃、30 000 g 下離心30 min；將沉淀重懸于Buffer B 溶液，冰浴4 h，再次于4 ℃、30 000 g 下離心30 min。棄去上清液，沉淀懸于Buffer C 溶液，用于氨肽酶及堿性磷酸酶活測定。

東方黏蟲中腸細胞BBMV 的制備質量檢測方法：將提取的BBMV 和中腸粗酶液作為反應物，分別測定其中堿性磷酸酶和氨肽酶的活性，比較獲得BBMV 的濃縮倍數，從而判斷其純度。

1.2.3 蛋白含量標準測定方法 以牛血清蛋白為標準，參照Bradford 的方法[20]測定。標準曲線制作：將1 mg/mL 的BSA 母液依次稀釋為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL；依次取10 μL 加入到96 孔板內，再加入190 μL 考馬斯亮藍G-250 溶液，混勻后室溫放置5～10 min，使用酶標儀在595 nm 處讀數。

樣品測定：將待測樣品稀釋至合適濃度，測定方法同標準曲線制作方法。

1.2.4 杠柳新苷類化合物對氨肽酶的活性測定 將供試6 個杠柳新苷類化合物用DMSO 配制成20、40、80 和200 μmol/L。氨肽酶的活性參考Hafkenscheid 等的方法[21]以Leu-pNA 為底物進行測定。稱取Leu-pNA 15.96 mg 溶于1 mL 甲醇中(現用現配)。在1.5 mL 無菌無酶離心管中加入底物反應緩沖液1 mL，分別將待測蛋白樣品10 μL，或其與杠柳新苷類化合物、陽性對照藥劑Bestatin 1.6 μL，于37 ℃水浴鍋中孵育30 min；再加入底物Leu-pNA 16 μL，于37 ℃水浴鍋中反應60 min。最后用全波長酶標儀于405 nm 下測定其相應吸光度。

1.2.5 杠柳新苷類化合物對堿性磷酸酶的活性測定 將供試6 個杠柳新苷類化合物用DMSO 配制成20、40、80 和200 μmol/L。堿性磷酸酶活性參照Lowry 等的方法[22]測定。在96 孔板中分別加入0.5 mL 酶液、2 mL 0.04 mol/L 的巴比妥鈉鹽酸緩沖液、或者1.75 mL 0.04 mol/L 的巴比妥鈉鹽酸緩沖液、0.25 mL 杠柳新苷類化合物或陽性對照藥劑Na2VO4、0.5 mL 7.5 mmol/L 對硝基苯磷酸二鈉，于37 ℃溫浴30 min。取出后加入2 mL 0.1 mol/L 的氫氧化鈉終止反應。常溫下平衡15 min，利用全波長酶標儀于405 nm 測定其相應吸光度值。

1.2.6 杠柳新苷類化合物對V-ATP 酶的活性測定 參照Tiburcy 等的方法測定[23]。挑取6 齡初未饑餓東方黏蟲幼蟲，解剖取中腸，棄去內容物及圍食膜。在解剖鏡下于預冷的Ringer Solution中去除馬氏管及食物殘渣，取中腸后部置于預冷的低吸附EP 管中。于液氮中迅速冷凍后，加入20 μL Lysis buffer-PIC，于冰上用微量勻漿棒充分勻漿，補足體積至200 μL。于20 000 r/min、4 ℃下離心20 min；棄去上清液，加入200 μL Lysis Buffer-PIC，重懸沉淀，于20 000 r/min、4 ℃下，離心20 min。棄去上清液后，將沉淀溶解于200 μL Lysis Buffer + PIC，采用Broadford 法測蛋白濃度后，用于后續酶活測定。

于1.5 mL EP 管中分別加入50 μL Buffer PO、20 μL MV 和20 μL KN，隨后加入40 μL 上述步驟獲得的酶液、10 μL DMSO 或供試化合物或Bafilomycin A1 (陽性對照)，每處理3 次重復。于30 ℃孵育10 min 后，依次向每個離心管中加入20 μL 底物Tris-ATP (8 mmol/L)，于30 ℃孵育1 h。終止反應時，依次按照加入底物的順序將離心管置于液氮中，于 -20 ℃保存用于無機磷含量測定。

無機磷含量測定參考Wieczorek 等方法[24]。于1.5 mL 離心管內吸取100 μL 鉬酸鹽 (molybdate)溶液，向酶促反應后的樣品管1 內加入50 μL 20%三氯乙酸 (TCA) 溶液，于70 ℃反應15 s；隨后分別于30 s、1.5 min 和2 min 時依次向樣品管2、3、4 中加入50 μL TCA 溶液，于70 ℃反應15 s。2 min 時，將樣品管1～4 離心1 min。分別于3.5、4、4.5 和5 min 時，依次取樣品管1～4 中的上清液60 μL，加入到100 μL molybdate 中溶解并混勻；反應15 s 后，依次向上述混合液中加入30 μL 孔雀石綠，混勻；反應2 min 后，再依次向上述混合液中加入200 μL H2SO4并混勻；室溫孵育70 min 后于625 nm 波長下測定其吸光度。

參考Cheng 等方法[25]通過標準曲線計算得到無機磷的含量：將105 ℃烘干至恒重的KH2PO4用雙蒸水 (ddH2O) 配制成1 mmol/L 的母液，再用ddH2O 將母液稀釋50 倍，制成0.02 mmol/L 的標準溶液。取10 個不同量的標準溶液分別于10 個試管內 (濃度分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L)，加入ddH2O 使每個試管內的體積均為1 mL。每管內加入0.5 mL 20% TCA 和0.4 mL 酸性鉬酸鈉，搖勻后15 s，再加入0.3 mL孔雀綠試劑，反應2 min 后加入2 mL 7.8%硫酸，室溫放置70 min 后，于625 nm 處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標，磷的含量為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 數據統計分析 數據分析均采用SPSS20.0軟件 (SPSS Inc., Chicago, USA) 進行統計分析。光度計測定數據均采用平均值 ± 標準差 (Mean ± SD)表示。組間比較采用單因素方差分析 (One-way ANOVA)，P ＜ 0.05 為差異顯著。每個獨立試驗及處理均至少進行3 次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 杠柳新苷類化合物的殺蟲活性

測定結果如表1 所示：在6 個化合物中，PSP和PST 對3 齡東方黏蟲幼蟲表現出較強的殺蟲活性，其LC50值分別為1.60 和1.23 mg/mL；PSA、PSD 和PSF 均表現出微弱的殺蟲活性，其LC50值分別為28.68、22.44 和21.31 mg/mL；PSE 則無明顯殺蟲活性。

2.2 杠柳新苷類化合物對BBMV 中氨肽酶和堿性磷酸酶活性的影響

結果表明，6 個杠柳新苷類化合物在20、40、80、200 μmol/L 濃度下，對氨肽酶和堿性磷酸酶的活性均沒有明顯抑制作用，與溶劑對照DMSO組的結果相同。而陽性對照氨肽酶特異性抑制劑Bestatin 在10 μmol/L 下對氨肽酶的抑制率可達到50%以上，堿性磷酸酶特異性抑制劑Na2VO4在100 μmol/L 下對堿性磷酸酶的抑制率可達到70%以上。

2.3 杠柳新苷類化合物對V-ATP 酶活性的影響

杠柳新苷類化合物對東方黏蟲幼蟲中腸細胞BBMV 中V-ATP 酶活性的影響如圖1 所示。陽性對照Bafilomycin A1 為V-ATP 酶一種特異的抑制劑，在所有單獨試驗組中均表現出顯著抑制，在3 μmol/L 濃度下抑制率達到45%左右；而6 個化合物中，僅有PSP 和PST 對V-ATP 酶表現出顯著抑制，PSA、PSD、PSE 和PSF 對其均無顯著的抑制作用。

為驗證杠柳新苷類化合物對V-ATP 酶活性影響的準確性，每組試驗中均設置了陽性對照和杠柳新苷的聯合處理。如果杠柳新苷的作用對象不是V-ATP 酶而是其他酶類，那么聯合用藥處理后其抑制效果將呈現加成作用，其抑制率將明顯高于二者單獨作用時的處理效果。從圖1 可以看出，在聯合用藥下，對V-ATP 酶活性的影響均與陽性對照Bafilomycin A1 無顯著性差異，這也進一步說明杠柳新苷類化合物PSP 和PST 確實抑制了V-ATP 酶的活性。另外，從圖1E 和1F 中可以看出，杠柳新苷對V-ATP 酶的活性表現出一定的濃度依賴性。因此，推測V-ATP 酶為杠柳新苷類殺蟲活性化合物的作用靶酶。

3 討論與結論

生物測定結果表明，在6 個供試杠柳新苷類化合物中，PSP 和PST 對3 齡東方黏蟲幼蟲表現出較強的殺蟲活性，PSA、PSD 和PSF 僅具有微弱的殺蟲活性，而PSE 則無明顯殺蟲活性。對3 種疑似靶標酶酶活影響的測定結果表明，6 個杠柳新苷類化合物對東方黏蟲幼蟲中腸細胞BBMV中的氨肽酶和堿性磷酸酶均無顯著作用；而對于V-ATP 酶，只有高殺蟲活性的PSP 和PST 對其酶活有顯著的抑制，且具有明顯的濃度依賴性，其余化合物對V-ATP 酶的活性在測定濃度內均無顯著影響；同時，陽性對照藥劑Bafilomycin A1 與杠柳新苷類化合物的聯合用藥進一步驗證了這一結果。基于此，本研究認為氨肽酶和堿性磷酸酶不是杠柳新苷類殺蟲活性化合物在東方黏蟲幼蟲中腸的作用靶標，而其活性位點可能存在于V-ATP酶上。

V-ATP 酶，又稱為液泡 (vacuolar) ATP 酶，最早是由Anraku 與其同事于1981 年首次在酵母細胞的液泡膜上發現的一種傳輸質子的ATP 酶[26]。此后，在各種動植物和真菌中也陸續發現了V-ATP酶的存在[27]。目前，發現V-ATP 酶廣泛存在于細胞原生質膜和各種細胞器內膜系統，如溶酶體、內膜體、高爾基體和分泌顆粒等[28]。V-ATP 酶水解ATP，產生的能量維持質子 (H+) 轉運，從而建立跨膜質子電化學梯度，實現膜內外pH 值調節，酸化細胞內外環境，為后續的細胞內吞、外泌和物質轉運等生理生化反應提供了必需條件[29]。最近對植物殺蟲劑苦皮藤素的相關研究表明，VATP 酶H 亞基可能為苦皮藤素在昆蟲體內的一個作用靶標，并由此提出一個苦皮藤素作用于VATP 酶的假說，即苦皮藤素等活性化合物與VATP 酶H 亞基上的某些氨基酸相互結合，從而抑制了V-ATP 酶全酶形態的形成，進而影響其活性，使其不能發揮正常作用[7]。理論上，如果活性化合物可與V-ATP 酶的某個亞基結合，但若不能抑制全酶的活力，則不能對其功能產生影響，對昆蟲也就無任何作用。因此，對于酶學研究而言，首先應明確活性化合物是否對全酶活性產生了影響，再進而研究其具體的作用機理。本研究結果表明，杠柳新苷類殺蟲活性化合物可顯著抑制東方黏蟲幼蟲中腸細胞BBMV 中V-ATP 酶的活性。定量差異蛋白組學研究表明，東方黏蟲幼蟲取食杠柳新苷類殺蟲活性化合物后，其中腸細胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亞基表現出顯著的上調表達[17]。蛋白組學分析發現，經Cry1Ac 毒素處理的煙芽夜蛾 Heliothis virescens 幼蟲中腸細胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亞基表現出上調，推測毒素與A 亞基結合可干擾H+/K+的正常轉運，破壞了離子平衡及pH 值的穩定性，認為V-ATP 酶A 亞基為Cry1Ac 毒素在煙芽天蛾中腸的一個特異結合蛋白[30]。同樣，蛋白組學研究表明，棉鈴蟲Helicoverpa armigera 幼蟲經Bt 處理后，其中腸細胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亞基也表現出顯著的上調表達，推測昆蟲體內需要大量的能量用于應對毒素壓力，而A 亞基的大量表達正是用于更多能量的提供[31]。本研究中杠柳新苷類殺蟲活性化合物引起東方黏蟲幼蟲中腸細胞BBMV 中的VATP 酶A 亞基上調表達的原因可能與上述研究推測相似，即昆蟲幼蟲在取食活性化合物后，為應對這外源物脅迫壓力，昆蟲中腸需要消耗更多的能量，導致昆蟲中腸內的V-ATP 酶A 亞基的數量大量增加。但是，對于昆蟲體內V-ATP 酶全酶活性而言，導致其被抑制的因素有很多，如溫度、pH 環境，或者亞基之間的組裝過程，復合體V0與V1之間的裝配過程等等，與單亞基本身數量的多少并沒有必然聯系[32]。基于此，筆者推測杠柳新苷類活性化合物可能與V-ATP 酶A 亞基相互結合后改變了A 亞基的正常構型，使V0和V1復合體不能正常解離和裝配，進而造成V-ATP酶全酶構型發生改變，致使全酶活性降低或者喪失。

鑒于杠柳新苷類殺蟲活性化合物對氨肽酶和堿性磷酸酶的活性無影響，卻顯著抑制了VATP 酶的活性，并表現出一定的濃度依賴性，結合定量差異蛋白質組學的研究結果，筆者認為杠柳新苷類殺蟲活性化合物的初始作用位點位于VATP 酶A 亞基上。此發現對研究杠柳新苷類殺蟲活性化合物的具體作用機制具有重要的指導意義，為進一步發現并驗證其特異靶標位點奠定了理論基礎。