己唑醇及其對映體對人體乳腺癌細胞的選擇毒性及氧化損傷研究

蘭 陽, 孫大利,2, 龐俊曉, 孫曉紅

(1. 貴州醫科大學 公共衛生學院/環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州醫科大學食品科學學院，貴陽 550025；3. 貴陽學院 食品與制藥工程學院，貴陽 550005)

0 引言

己唑醇 (hexaconazole) 屬三唑類高效殺菌劑，因其良好的殺菌效果被廣泛應用于水稻紋枯病、蘋果白粉病和小麥銹病等病害的防治[1-2]。但己唑醇較難降解，容易通過農田進入環境，進而對人體健康造成一定程度的危害。己唑醇具有一個手性中心，存在兩個對映異構體，屬于手性農藥。農藥對映異構體 (以下簡稱對映體)在環境中的遷移、轉化、降解以及在生物體內的吸收、轉移、代謝、分布和排泄過程中均可表現出不同的行為，從而導致其具有不同的環境行為、生物活性及毒性作用[3-4]。例如，R-丙溴磷對小鼠的毒性大于S-丙溴磷，但對乙酰膽堿酯酶活性的影響則相反[5]。因此，只有在對映體水平上研究其所引起的環境行為和毒性才能更全面地評估手性農藥對生態環境及人類健康所帶來的風險。閆冬艷[6]研究了吡噻菌胺和丙硫菌唑兩種新型手性農藥對HepG2細胞的對映體選擇性毒性，得出細胞毒性機制為吡噻菌胺峰1＞吡噻菌胺峰2＞吡噻菌胺外消旋體以及丙硫菌唑峰2＞丙硫菌唑外消旋體＞丙硫菌唑峰1 的研究結果。楊桂玲等[7]明確了 8 種農藥多殘留組合對HepG2 人肝癌細胞增殖的抑制效應，在所測定的 22 個農藥組合中，大多數組合的劑量-效應關系基本符合傳統的毒理學劑量-效應曲線關系，證實了農藥多殘留在較低的劑量下即有可能產生較強的細胞毒性作用。

相關研究表明，己唑醇對映體在不同生物體內所引起的毒性存在差異性，甚至毒性作用完全相反[8]。有關己唑醇在兔子[9]、黃瓜[10]、大型溞及斑馬魚[11]等動植物體內的立體選擇性研究已有報道，但其對人體細胞的選擇性毒性研究尚未見報道。己唑醇已被歐盟 (EU) 和世界自然基金組織 (WWF)列為具有生殖和內分泌干擾毒性的化合物之一[12]。人體乳腺癌細胞MCF-7 具有容易獲得、在實驗室條件下容易培養繁殖、培養成本低、對已唑醇毒性比較敏感以及發育成熟期短等優勢。農藥對生物體或細胞造成的毒性損傷通常與ROS 的形成有關[13-14]，一旦接觸到污染物，生物或細胞就會建立防御系統，之后通過酶和非酶抗氧化劑來消除損害。活性氧(ROS)的形成可影響超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 和過氧化氫酶 (catalase,CAT) 的活性，從而誘導氧化損傷[15-16]。因此，氧化應激被廣泛用于研究污染物對生物體或細胞的毒性[17-19]。

為了明確己唑醇對映體的選擇性毒性及其作用機制，本研究以MCF-7 作為體外模型，從對映體水平上研究了細胞活力及氧化應激性存在的差異，旨在對映體層面開展己唑醇的研究，并深入研究對映體的選擇性毒性及其作用機制，以便為由已唑醇引起的環境行為和毒性效應做出更全面的風險評估，為篩選高效且生物低毒的對映體單體提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

人體乳腺癌MCF-7 細胞由貴州醫科大學藥學院提供。rac-己唑醇 (外消旋體) 標準品純度為99.0%，購自Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司 (Augsberg，德國)。(+)-己唑醇和 (-)-己唑醇純光學對映體標準品純度為99.0%，購自上海勤路生物技術有限公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 試劑盒購自DOJINDO 公司 (日本熊本)。乳酸脫氫酶 (LDH)、活性氧 (ROS)、超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 高糖培養基、胰酶消化液和青霉素-鏈霉素購自加拿大Wisent Biotechnology 公司。胎牛血清 (FBS) 購自杭州四季青生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

BPN—50CH 二氧化碳培養箱 (上海一恒，中國)；超凈工作臺 (蘇州金凈，中國)；SYNERGY H4 型熒光多功能酶標儀 (Bio TeK，美國)；CKX31倒置生物顯微鏡 (Olympus，日本)；1510 型酶標儀 (Thermo Fisher，美國)；液氮儲存罐 (東亞YDS SOB)；AUW120D 型分析天平 (Shimadzu，日本)；移液槍 (Eppendorf，德國)；TG20K 高速冷凍離心機 (上海舜制儀器制造有限公司，中國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養及樣品前處理 細胞培養及樣品前處理參照孫大利報道的方法[20]。細胞培養液為含10% FBS 和1%青霉素鏈霉素的DMEM 培養液，培養液每2 d 更換1 次。細胞置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養。為了測定己唑醇對映體對MCF-7 細胞的毒性及氧化損傷情況，將濃度約為5 × 104cells/mL 的細胞懸浮液分別加入24 孔板或96 孔板中，置于培養箱中培養24 h，用含不同質量濃度rac-、(+)-和 (-)-己唑醇的DMEM 培養液替換原培養液，進行染毒試驗。

1.3.2 細胞活性測定 取上述含有MCF-7 細胞的懸浮液 (濃度約為5 × 104cells/mL) 100 μL，加入96 孔板中培養24 h；移去細胞培養液，用PBS 清洗3 次。分別加入110 μL 含有10、20、40、80和160 mg/L rac-、(+)-和 (-)-己唑醇的DMEM 培養液。同時設空白組和對照組。空白組為100 μL D E M E 培養液(無細胞)；對照組為1 0 0 μ L DMEM 培養液和細胞。每濃度或空白重復3 次。將加樣后的96 孔板置于培養箱中染毒24 h。參照試劑盒說明書，向每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，置于培養箱中孵育1 h，使得CCK-8 還原為甲瓚。采用酶標儀測定波長450 nm 下的吸光度。

1.3.3 細胞氧化損傷的測定

1.3.3.1 LDH 釋放量的測定 將MCF-7 細胞 (濃度約為5 × 104cells/mL) 在24 孔板中培養24 h，移去細胞培養液，分別加入含有20、40 和80 mg/L rac-、(+)-和 (-)-己唑醇的DMEM 培養液，于培養箱中暴露24 h。每濃度重復3 次。根據試劑盒中提供的檢測方法 (表1)，采用酶標儀測定波長440 nm下的熒光吸收值，計算細胞釋放的LDH 含量。

表1 各處理組乳酸鹽脫氫酶 (LDH) 活性測定反應體系Table1 The reaction system of LDH activity measurement in each treatment group (μL)

1.3.3.2 ROS 含量測定 將細胞 (濃度約為5 × 104cells/mL) 在96 孔板中培養24 h，移去細胞培養液，分別加入含有20、40 和80 mg/L rac-、(+)- 和(-)-己唑醇的DMEM 培養液，于培養箱中暴露24 h。除去染毒培養液，用PBS 洗滌細胞3 次，同時設空白對照組及陽性對照組。空白對照組以細胞培養液代替染毒培養液。活性氧陽性對照(ROSup) 組以稀釋后的陽性對照液 (無酚紅DMEM 以體積比1 : 1 000 稀釋) 代替細胞培養液。DCF-DA 溶液用無酚紅DMEM 以體積比為1 : 1 000 的比例稀釋，配成工作液。向每孔中加入100 μL 稀釋后的DCFH-DA 工作液，在37 ℃培養箱中孵育30 min 后棄去上層液體，用無酚紅DMEM 洗滌細胞3 次，除去未進入細胞的DCFHDA。最后，向每孔加入100 μL PBS。每濃度處理重復3 次。在酶標儀下，以485 nm 為激發波長、525 nm 為發射波長，測定熒光值。

1.3.3.3 SOD 及CAT 酶活性測定 為了檢測細胞中SOD 和CAT 酶活性，向24 孔細胞培養板中加入2 mL 濃度為5 × 104cells/mL 的細胞懸浮液。培養24 h 后，分別用含有20、40 和80 mg/L rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇的DMEM 培養液替換原細胞培養液，同時設置空白對照組。每處理重復3 次。染毒24 h 后，棄去上層培養液，用PBS 洗滌細胞3 次。每孔加入300 μL 細胞裂解液，裂解30 min后用微量移液器吸出，待測。按照試劑盒中的檢測方法(表2 和表3)。分別向5 mL 離心管中依次加入表中試劑，每濃度重復3 次，混合均勻后，室溫靜置10 min。分別在550 nm 及405 nm 的熒光波長下測定SOD 酶及CAT 酶活性。

表2 各處理組細胞內SOD 活性測定反應體系Table2 The reaction system of SOD activity measurement in each treatment group (μL)

表3 各處理組細胞內過氧化氫酶 (CAT) 活性測定反應體系Table3 The reaction system of CAT activity measurement in each treatment group (mL)

1.4 數據處理

所有處理均設置3 個平行，數據以Mean ±SD 表示。全部數據利用軟件SPSS17.0 進行統計分析，各組間的顯著性檢驗采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步進行組間兩兩比較，若方差齊時，采用Student-Newman-Keuls 檢驗；若方差不齊，則采用Tamhane’s 檢驗，以P ＜ 0.05認為差異有統計學意義。* 表示單個對映體或者外消旋體與對照組之間存在顯著性差異 (P ＜ 0.05)。相同字母代表對映體之間或者對映體與外消旋體之間不存在顯著性差異，不同字母則代表二者之間存在顯著性差異 (P ＜ 0.05)。

2 結果與分析

2.1 己唑醇及其對映體處理對MCF-7 細胞形態的影響

不同濃度的己唑醇暴露24 h 后，3 種結構形式的己唑醇對MCF-7 細胞形態均有不同程度的破壞。隨著暴露濃度增加，細胞形態損傷越發嚴重，可見細胞形態損傷程度與已唑醇暴露濃度呈正相關。

圖1 為空白對照及20、40 和80 mg/L 的rac-己唑醇處理后MCF-7 細胞形態變化情況。空白對照組的細胞貼壁生長良好，細胞形態完整，幾乎覆蓋整個培養皿 (圖1A)；當培養液中rac-己唑醇的質量濃度為20 mg/L 時，與空白對照組相比，細胞狀態良好，但體積有一定增大；當其質量濃度增加到40 mg/L 時，細胞開始出現損傷，體積增大，細胞數量開始減少，死亡細胞失去黏性漂浮在培養液中，細胞形態不再是正常的菱形；當其質量濃度增加到80 mg/L 時，細胞受到損傷，很難觀察到狀態良好的細胞，大量的細胞漂浮于培養液中，說明在此濃度下，rac-己唑醇對MCF-7 細胞造成了損傷。

圖2 為空白對照、20、40 和80 mg/L 的 (+)-己唑醇處理后MCF-7 細胞形態的變化。不含己唑醇的細胞貼壁生長良好，幾乎覆蓋了整個培養皿；當 (+)-己唑醇質量濃度為20 mg/L 時，少量細胞開始增大，鏡下可見少量亮斑，說明在此濃度下，(+)-己唑醇對細胞形態有一定影響；當 (+)-己唑醇增加到40 mg/L 時，細胞黏性減弱，半數細胞漂浮在培養液中，細胞形態不能維持正常的菱形；當 (+)-己唑醇質量濃度增加到80 mg/L 時，細胞開始溶解，鏡下觀察不到貼壁的正常細胞，幾乎全部漂浮于培養液中，說明在此濃度下 (+)-己唑醇對MCF-7 細胞造成了損傷。

圖3 為空白對照組及經20、40、80 mg/L 的(-)-己唑醇處理后MCF-7 細胞形態的變化。空白組的細胞貼壁生長良好，幾乎覆蓋了整個培養皿；當 (-)-己唑醇的質量濃度為20 mg/L 時，細胞體積開始增大，鏡下可見少量細胞浮漂于培養液中；當 (-)-己唑醇增加到40 mg/L 時，大量細胞形態被改變，細胞數量大幅減少，半數細胞漂浮在培養液中；當 (-)-己唑醇增加到80 mg/L 時，細胞開始溶解，細胞數量急劇減少，幾乎全部漂浮于培養液中，說明在此質量濃度下，(-)-己唑醇對MCF-7 細胞造成了較大的損傷。

2.2 己唑醇對MCF-7 的細胞毒性

在本研究中，采用CCK-8 法測定了己唑醇及其對映體對MCF-7 細胞活性的影響。如圖4 所示，當己唑醇從10 mg/L 增加到160 mg/L 時，細胞活性急劇下降。細胞活性與藥劑質量濃度間呈現出劑量-效應關系。在10 mg/L 時，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理24 h 后的MCF-7 細胞活性分別為103.87%、87.11%和85.24%。與空白組相比，經rac-己唑醇處理后細胞活性無顯著性差異，(+)- 和 (-)-己唑醇存在顯著性差異 (P ＜0.05)。3 種形式的己唑醇之間，(+)- 和 (-)-己唑醇處理后的MCF-7 細胞活性無顯著性差異，但與rac-己唑醇相比，均存在顯著性差異 (P ＜ 0.05)。當其質量濃度增加至40 mg/L 時，MCF-7 的細胞活性明顯下降，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后的細胞活性分別降為81.05%、68.08%和60.78%，并且經3 種形式的己唑醇處理后MCF-7 細胞活性均表現出顯著性差異 (P ＜ 0.05)。MCF-7 細胞對于(-)-己唑醇最為敏感。當質量濃度分別為80 和160 mg/L 時，與空白組相比，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后MCF-7 細胞存活率分別降低至9.37%、8.92% 和5.73%，5.24%、5.11%和4.07%。與空白組相比，3 種形式的己唑醇處理對MCF-7 細胞活性的影響均存在極顯著性差異 (P ＜ 0.01)。3 種形式的己唑醇，對MCF-7 細胞活性的影響無顯著性差異。結果表明，在設置劑量下，(-)-己唑醇對MCF-7 細胞活性抑制率最高，其次為 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。

2.3 己唑醇對MCF-7 細胞氧化損傷的影響

2.3.1 對LDH 釋放量的影響 細胞內LDH 的釋放量通常被認為是細胞膜損傷程度的標志。如圖5 所示，經過不同濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，細胞外LDH 的含量與空白對照相比顯著增加 (P ＜ 0.05)。當質量濃度為20 mg/L 時，經過rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇暴露后，釋放到細胞外的LDH 含量分別是空白對照組的1.45、1.61和1.64 倍。經 (-)-己唑醇處理后細胞液中LDH 的相對含量比經rac- 和 (+)-己唑醇處理后的顯著增加 (P ＜ 0.05)；在40 mg/L 時，釋放到細胞外的LDH 含量分別是空白對照組的1.45、1.61 和1.64 倍，經 (-)- 和 (+)-己唑醇處理后細胞液中的LDH 相對含量比經rac-己唑醇處理后的顯著增加(P ＜ 0.05)；當質量濃度為80 mg/L 時，細胞外的LDH 含量分別是空白對照組的1.62、1.88 和1.87 倍，經 (-)- 和 (+)-己唑醇處理后的細胞液中的LDH 相對含量比經rac-己唑醇處理后的顯著增加 (P ＜ 0.05)。結果表明，在設置劑量下，3 種形式的己唑醇對MCF-7 細胞膜損傷程度大小為 (-)-己唑醇＞(+)-己唑醇＞rac-己唑醇。

2.3.2 對ROS 生成的影響 如圖6 所示，經不同質量濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，MCF-7 細胞內ROS 釋放量隨著藥劑質量濃度的增加呈現先升高再下降的趨勢，即呈“倒U”情況。經20 mg/L 的 (-)-、(+)- 和rac-己唑醇處理，細胞內ROS 的相對含量分別為空白組的4.11、4.04 和3.56 倍，ROS 釋放量顯著增加 (P ＜ 0.05)，3 種形式的己唑醇之間沒有顯著性差異；經40 mg/L 的(-)-、(+)- 和rac-己唑醇處理，細胞內ROS 的相對含量分別為空白對照組的2 0.4 2、1 9.7 6 和19.08 倍，顯著增加 (P ＜ 0.05)。值得注意的是，經80 mg/L 的 (-)-、(+)- 和rac-己唑醇處理后，細胞內ROS 的相對含量為空白組的2.97、2.97 和2.16 倍。細胞內ROS 產生量與己唑醇質量濃度為40 mg/L 時相比顯著降低，這可能是由于在此濃度下酶活性的增加量不足以清除高濃度己唑醇對細胞的損傷，從而導致適應性機制的喪失[21]。

2.3.3 對SOD 酶活性的影響 如圖7 所示，經不同質量濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，MCF-7 細胞內SOD 酶活性隨著藥劑質量濃度的增加呈現先升高再下降趨勢。經20 mg/L 的己唑醇暴露24 h 后，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后細胞內SOD 酶活性分別為對照的1.02，1.04 和1.04 倍，與空白組相比無顯著性差異；3 種形式的己唑醇之間也無顯著性差異。與空白組相比，經40 mg/L 的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后，細胞內SOD 酶活性分別增加1.22、1.27 和1.50 倍，均呈現出顯著性差異 (P ＜ 0.05)；3 種形式的己唑醇之間也呈現出顯著性差異 (P ＜ 0.05)。其中，由(-)-己唑醇處理所引起的SOD 酶活性增長值最高，其次是 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。然而，當其質量濃度為80 mg/L 時，與空白組相比，rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇處理后細胞內SOD 酶活性分別降低至0.61、0.54 和0.53 倍。這可能是因為SOD 可將ROS 轉化為H2O2，過量的ROS 已經超出了SOD 的轉化能力，SOD 酶的氨基酸側鏈被氧化，進而失去了部分功能[22]。

2.3.4 對CAT 酶活性的影響 由圖8 所示，與空白組相比，經過不同質量濃度己唑醇處理后，細胞內CAT 酶活性隨著質量濃度的增加而逐漸增加，己唑醇對MCF-7 細胞中CAT 酶活性存在劑量-效應關系。當己唑醇質量濃度為20 mg/L 時，3 種形式的己唑醇處理后CAT 酶活性分別是空白組的1.13、1.18 和1.23倍，差異顯著 (P ＜ 0.05)，且3 種形式的己唑醇間也呈現出顯著性差異 (P ＜0.05)；當其質量濃度為40 mg/L時，3 種處理的CAT 酶活性分別是空白組的1.26、1.45 和1.46倍，其中 (-)- 和 (+)-己唑醇處理后細胞內CAT 酶活性顯著高于rac-己唑醇 (P ＜ 0.05)；而在80 mg/L時，CAT 酶活性分別提高到1.58、1.61 和1.65倍，(-)-己唑醇處理后細胞內CAT 酶活性顯著高于 (+)- 和rac-己唑醇 (P ＜ 0.05)。由此可見，在相同質量濃度下，(-)-己唑醇處理后細胞內CAT 酶活性最高，其次是 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。

3 結論與討論

本研究以MCF-7 細胞為受試對象，分別用10～160 mg/L 5 個質量濃度的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇染毒24 h 后，測得MCF-7 細胞活性分別從85.24%、87.11%和103.87%降至4.07%、5.11%和5.24%。由此可見，(-)-己唑醇對MCF-7 細胞活性的抑制率最高，其次為 (+)-己唑醇和rac-己唑醇。梁宏斌[11]從對映體水平上開展了己唑醇對大型溞及斑馬魚的急性毒性試驗。結果表明，己唑醇對映體對大型溞和斑馬魚的急性毒性結果較為一致，均是 (-)-己唑醇＞rac-己唑醇＞(+)-己唑醇。對斑馬魚的胚胎-魚仔發育影響試驗以及魚仔活動試驗結果顯示，對映體之間均存在毒性差異性，其結果與急性毒性試驗結果相一致。總體來說，(-)-己唑醇對生物的毒性最高，但在不同生物體內(+)-己唑醇與rac-己唑醇的毒性有所差異。這也與己唑醇不同對映體在不同生物體內所引起的毒性存在差異性，甚至毒性作用完全相反的結論相符。

氧化損傷檢測結果顯示，MCF-7 細胞經20、40 和80 mg/L 的rac-、(+)- 和 (-)-己唑醇暴露后，隨著己唑醇質量濃度的增加，細胞內LDH 釋放量升高，CAT 活性增強，但ROS 產生量和SOD 酶活性呈現“倒U”趨勢，這與其他手性農藥在MCF-7細胞研究中得到的結論有所不同。孫大利[20]從對映體水平上開展了乙螨唑對MCF-7 細胞的選擇性毒性研究。結果表明，經過不同濃度的乙螨唑對映體處理后，MCF-7 細胞中與氧化應激相關的如LDH 釋放量、ROS 含量以及與抗氧化活性有關的SOD 酶和CAT 酶活性均增加。這可能是因為在高濃度下酶活性的增加量不足以清除高濃度己唑醇對細胞的損傷，從而導致適應性機制的喪失[22]。近年來也有報道指出，外源化學物質的內分泌干擾作用并非呈現簡單的上升或下降趨勢，而可能出現“U”或者“倒U”等情況[23]。該結果提示，高濃度的己唑醇可能與細胞內分泌功能相關的通路或受體等有關聯。根據本研究的結果，己唑醇誘導的毒性和氧化損傷的模式可能是：己唑醇處理增加了細胞內ROS 的含量水平，觸發細胞氧化應激，改變了抗氧化酶活性。對于己唑醇誘導MCF-7 細胞選擇性毒性的分子機制則需進一步研究。

手性農藥約占全球農藥市場的35%，并且市售手性農藥中很大部分以外消旋體的形式存在，而絕大多數手性農藥的風險評估是將外消旋體作為單一物質來進行的[6]。已有研究表明，手性農藥的不同對映異構體在與生物體相互作用時會表現出顯著性差異，不同對映異構體在自然界中的遷移轉化等過程具有不同的生理、生化和毒性作用[24-25]。相關研究表明，己唑醇具有內分泌毒性，MCF-7 作為人體內分泌腺細胞對己唑醇的毒性反應較明顯且直接，便于觀察研究。本研究在對映體水平上探明了己唑醇對MCF-7 細胞的選擇毒性及氧化損傷，為研究己唑醇的細胞毒性機制和開展手性單體的開發利用、減少外消旋體帶來的環境污染提供了科學依據。