2-溴-4-氟乙酰苯胺在雄性大鼠體內的毒物動力學行為

朱狄峰, 童振軒, 洪雅雯, 陳 超, 趙劍嵐, 平 麗

(浙江大學 藥學院 藥物安全評價研究中心，杭州 310058)

通過構效關系分析合成相同母核、不同取代基團的化合物是目前研究開發新型農藥的主要方式之一[1-2]。N-苯基酰胺類化合物作為重要的內吸性殺菌劑，被廣泛用于農藥、醫藥和化工等領域，常見的有甲霜靈 (metalaxyl)、苯霜靈 (benalaxyl)及噁霜靈 (oxadixyl) 等，這類化合物長期使用易產生抗性或出現藥物敏感性下降的問題[3-4]。2-溴-4-氟乙酰苯胺 (2-bromo-4-fluoroacetanilide，BFAA，結構式見圖式1) 屬于新型N-苯基酰胺類含氟化合物，引入的氟原子可增強藥物分子對生物膜的通透性，具有更優良的親脂性和吸收速率，可以之為骨架合成N-苯基酰胺類化合物，用于殺菌、除草[5]，同時其也是合成殺菌劑聯苯吡菌胺 (bixafen) 的關鍵中間體和主要雜質[6]。此外，2-溴-4-氟乙酰苯胺還被作為磺胺類藥物的原料和中間體，用于生產止痛劑和退熱劑[7]。目前對2-溴-4-氟乙酰苯胺的研究主要集中在其化學合成方面。根據經濟合作與發展組織 (OECD) 全球化學品信息平臺信息，2-溴-4-氟乙酰苯胺無刺激性、無腐蝕性、無遺傳毒性，屬于低毒物質[8]，但尚未見有關其在動物體內代謝及組織分布情況等的研究報道。毒物動力學研究對農藥作用機制評價和毒理學風險評估具有非常重要的作用[9-10]。為探明2-溴-4-氟乙酰苯胺在生物體內分布及代謝情況，本研究利用超高效液相色譜-串聯質譜 (UPLC-MS/MS) 方法，對大鼠給予2-溴-4-氟乙酰苯胺后的毒代動力學、組織分布及排泄過程進行研究，旨在為深入研究2-溴-4-氟乙酰苯胺的毒理學作用機制及其用藥安全性評估提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥物和試劑

液相色譜系統為ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀，質譜系統為配備ESI 離子源的Xevo TQ 三重四極桿串聯質譜儀，數據采集由MassLynx V4.1 軟件控制并處理 (美國Waters 公司)；Minispin離心機及5810R 離心機 (德國Eppendorf 公司)；XS205 電子分析天平 (精度0.01 mg) 及PB1501-L電子天平 (精度0.1 g) (瑞士METTLER TOLEDO公司)；Purelab OptionS7 超純水系統 (英國ELGA LabWater 公司)；JAC 4 020 超聲波清洗器 (韓國KODO 技術研究有限公司)；MTV-100 多管漩渦混合儀 (杭州奧盛儀器有限公司)；Voetex 2 混勻器(德國IKA 公司)。

2-溴-4-氟乙酰苯胺 (2-bromo-4-fluoroacetanilide，BFAA) 及標準對照品 (純度均為99.92%，北京新岸諾亞催化科技有限公司)；內標 (IS) 為氯雷他定(loratadine，純度100.0%，中國食品藥品檢定研究院)。試劑甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純；羧甲基纖維素鈉和蓖麻油聚氧乙烯醚為化學純；超純水(自制)。

1.2 實驗動物

動物實驗方案由浙江大學藥物安全評價中心動物實驗委員會審定。SPF 級、約6～8 周齡的雄性SD 大鼠50 只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK (京) 2016-0006。實驗動物的飼養和使用遵守《實驗動物管理條例》(1988 年) 和《浙江省實驗動物管理辦法》(2009 年)，實驗動物使用許可證號為SYXK (浙)2018-0001。動物房溫度22.3～25.2 ℃，相對濕度45.2%～65.7%，每1 h 換氣次數 ≥ 15 次，每12 h明/暗交替。實驗動物的使用遵循3 R (reduction、replacement 和refinement) 原則，動物實驗場地已通過國際實驗動物評估和認可委員會 (AAALAC)的認證。

1.3 動物分組及處理劑量設計

根據體重 (不超過平均體重的20%) 隨機篩選出45 只大鼠，分成3 個試驗組群，分別進行吸收試驗、組織分布試驗和排泄試驗。前期預試驗結果顯示，給予1 000 mg/kg 劑量2-溴-4-氟乙酰苯胺處理未見嚴重毒性反應，驗證了其屬于低毒性物質。按照OECD “化學品測試指南 (guidelines for the testing of chemicals)”[11]和環境保護部《化學品測試方法》[12]要求，以1 000 mg/kg 作為經口染毒的高劑量。吸收試驗共用大鼠20 只，分為灌胃染毒低、中、高劑量組和靜脈注射組，染毒劑量分別為200、500、1 000 和20 mg/kg，每組5 只；組織分布試驗共用大鼠20 只，灌胃染毒劑量為1 000 mg/kg，分別設4 個采樣時間點 (0.5、2、8 和24 h)，每時間點5 只；排泄試驗共用大鼠5 只，為1 個灌胃染毒組，劑量為1 000 mg/kg。

1.4 生物樣本采集及處理

大鼠染毒前禁食12 h。灌胃染毒藥物采用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解，靜脈注射染毒藥物采用4%的蓖麻油聚氧乙烯醚溶解。

毒物動力學研究中，灌胃染毒組于0、5、10、20、30、40 min 及1、1.5、2、3、4、6、10、24、48 h 分別取血，靜脈注射染毒組于0、5、10、20、40 min 及1、1.5、2、4、6、10、24、48 h 分別取血。血液樣品經肝素鈉抗凝后于3 000 r/min 下離心10 min 分離血漿。

組織分布研究中，動物染毒后分別于0.5、2、8 和24 h 收集心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、脂肪、肌肉、腦、睪丸、胃和小腸，采用預冷的生理鹽水沖洗凈血液和其他干擾物質，用濾紙吸干并稱重后，加入3 倍質量的生理鹽水，勻漿。

排泄研究中，將染毒后大鼠獨立放入代謝籠中進行采樣，尿液和糞便采樣時間均為0～12、12～24、24～48、48～72、72～96 和96～120 h。糞便用2 倍質量的50%甲醇處理后，離心分離上清液。

采用Michopoulos 等[13]報道的蛋白質沉淀法去除樣品中的雜質。分別取生物樣品 (血漿、組織勻漿、尿液和糞便上清液) 50 μL，加入150 μL 含內標氯雷他定 (5 ng/mL) 的甲醇沉淀蛋白，渦漩1 min，于10 000 r/min 下離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜后，采用UPLC-MS/MS 進行分析。

1.5 標準生物樣品和質控樣品溶液配制

分別稱取一定量2-溴-4-氟乙酰苯胺和內標氯雷他定對照品，用甲醇稀釋配制成1 mg/mL 的標準儲備液，試驗時進一步用甲醇稀釋獲得2-溴-4-氟乙酰苯胺系列標準工作溶液。分別取空白血漿，心臟、肝臟、脾臟、腎臟及肌肉組織混合勻漿，肺、脂肪、胃、小腸、腦和睪丸組織混合勻漿，以及尿液和糞便上清液，加入含內標氯雷他定的2-溴-4-氟乙酰苯胺標準儲備液，分別配制成0.2、0.5、2、8、20、50 和100 μg/mL的標準生物樣品溶液；同時用含內標氯雷他定的甲醇配制0.4、5、40 和80 μg/mL 的生物質控樣品溶液。

1.6 檢測條件

色譜條件：樣品通過ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (2.1 mm × 100 mm，1.7 μm) 進行分離后，以含體積分數0.1%甲酸的水 (A) 和乙腈 (B)作為流動相進行梯度洗脫。梯度洗脫程序：0 min，V (A) : V (B) = 90 : 10；2～3.5 min，V (A) : V (B) =5 : 95；4～5 min，V (A) : V (B) = 90 : 10。流速為0.3 mL/min，進樣量7 μL。自動進樣器保持在6 ℃，柱溫35 ℃。

質譜條件：采用正離子MRM 方式檢測，通過分別注入200 ng/mL 的2-溴-4-氟乙酰苯胺和氯雷他定溶液至質譜儀，獲得儀器優化參數為：毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流速700 L/h；碰撞氣流速0.15 mL/min，氣簾氣流速50 L/h。MRM 檢測離子 (m/z) 分別為232.00→111.07 (2-溴-4-氟乙酰苯胺) 和383.08→267.02 (氯雷他定)，錐孔電壓分別為32 和5 V，碰撞能量22 和32 eV。

方法學驗證主要參考Commission Decision 2002/657/EC[14]和Commission Regulation (EU) 2006/401[15]，考察了專屬性、線性、精密度、準確度、重復性、定量限、檢測限、回收率、基質效應和穩定性等。針對所建立方法進行了完整的方法學驗證，均滿足驗證標準[14-16]要求。

1.7 數據統計分析

通過MassLynx V4.1 軟件對血漿、組織、尿液和糞便樣本的UPLC-MS/MS 檢測數據進行采集和分析。血漿樣本濃度采用Data Analysis System 3.1 software (DAS, version 3.1) 軟件分析。采用非房室模型計算主要的動力學參數：藥-時曲線下面積 (area under curve，AUC)、血藥峰濃度 (Cmax)、血藥濃度達峰時間 (tmax)、半衰期 (t1/2) 以及平均駐留時間 (tmr) 等，并對藥物在組織中的分布及經尿液和糞便排泄情況進行分析。根據公式 1 計算各染毒劑量下SD 大鼠血漿中2-溴-4-氟乙酰苯胺的絕對生物利用度 (F)[16]。

式中，AUC(0-t)ig為灌胃染毒后給藥時間內藥-時曲線下面積，(mg/L)·h；AUC(0-t)iv為靜脈注射染毒后給藥時間內藥-時曲線下面積，(mg/L)·h；miv為靜脈注射染毒劑量，mg/kg；mig為灌胃染毒劑量，mg/kg。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優化

前期分別考察了不同粒徑、孔徑和柱長的多種UPLC 色譜柱的分離效果，最終發現采用ACQUITY UPLC BEH C18三鍵鍵合烷基色譜柱能獲得較好的峰形。對多種洗脫方法 [有機相包括甲醇、乙腈、二甲基亞砜 (DMSO) 及異丙醇等，水相包括不同濃度的甲酸-水、甲酸銨-水、三乙胺-水、三氟乙酸-水及乙酸銨-水等] 進行了篩選，發現采用乙腈作為有機相和在水相中加入體積分數0.1%的甲酸能明顯改善分析物峰形。在正離子模式下對錐孔電壓、碰撞能量、子離子對和母離子對等質譜條件進行了優化，最終得到1.6 節中各項優化后的質譜參數。在選定的UPLC-MS/MS條件下，2-溴-4-氟乙酰苯胺和內標氯雷他定的洗脫效果均良好，保留時間分別約為1.56 和1.42 min，典型色譜圖見圖1。標準曲線的線性范圍為0.2～100 μg/mL。

2.2 血漿毒物動力學結果

采用200、500、1 000 mg/kg 劑量的2-溴-4-氟乙酰苯胺灌胃和20 mg/kg 劑量靜脈注射染毒處理大鼠，通過所建立的UPLC-MS/MS 方法研究了2-溴-4-氟乙酰苯胺在大鼠血漿中的毒代動力學，測定了不同時間點的血藥濃度。其藥-時曲線見圖2，不同劑量染毒后大鼠血漿中2-溴-4-氟乙酰苯胺的毒代動力學參數與劑量的關系見圖3，其毒代動力學參數見表1。結果表明：大鼠灌胃染毒后藥物可被迅速吸收。500 mg/kg 劑量灌胃染毒組藥物吸收達到飽和，其Cmax值和 AUC(0-t)值分別為 (45.2 ±1.8) mg/L和 (393.3 ± 51.1) (mg/L)·h；1 000 mg/kg劑量灌胃染毒組 Cmax和AUC(0-t)值反而均出現下降趨勢；表明該毒代動力學變化無劑量依賴性，表現為非線性動力學特征。其曲線下面積比[R_AUC(t-∞)]均大于98.5%，且1 000 mg/kg 劑量組清除率 (CL) 僅為 (0.6 ± 0.1) (L/h)/kg，提示給藥時間內2-溴-4-氟乙酰苯胺即可大部分從動物體內消除。從圖2 可知，不同染毒劑量下，2-溴-4-氟乙酰苯胺的Cmax值均在給藥后4 h 開始下降，在6 h 后又出現上升趨勢，隨后再緩慢下降，該雙峰現象 (double-peak phenomenon) 表明，2-溴-4-氟乙酰苯胺在動物體內可能存在重吸收或腸-肝循環(EHC)。200、500 和1 000 mg/kg 3 個劑量組大鼠血漿中2-溴-4-氟乙酰苯胺的F 值分別為64.2%、83.3% 和34.1%，表明隨著劑量的大幅增加，1 000 mg/kg 處理下2-溴-4-氟乙酰苯胺在大鼠體內的絕對生物利用度較低劑量時下降較為明顯。

2.3 藥物在大鼠組織中的分布情況

結果見表2。其中，單次灌胃染毒后，2-溴-4-氟乙酰苯胺在大鼠組織中分布較廣，且除腎臟和胃外均具有相似的組織分布趨勢。給藥0.5 h 后，2-溴-4-氟乙酰苯胺在各組織中的含量從大到小依次為：小腸＞胃＞脂肪＞心臟＞脾臟＞肌肉＞腎臟＞腦＞肝臟＞睪丸＞肺，各組織中總的藥-時曲線下面積 (AUC(0-∞)) 從大到小依次為：小腸＞脂肪＞胃＞心臟＞腎臟＞脾臟＞肌肉＞腦＞肺＞肝臟＞睪丸，表明2-溴-4-氟乙酰苯胺主要分布在大鼠的小腸、胃和脂肪中，且小腸中含量最高，可達 (309.8 ± 39.5)mg/kg。同時，在大鼠腦組織中也發現了2-溴-4-氟乙酰苯胺，但含量較低，最高僅 (7.3 ± 1.3) mg/kg；另有極少量的2-溴-4-氟乙酰苯胺可到達睪丸；表明該化合物由于具有較高的脂溶性和較低的相對分子質量，因而可穿越血腦屏障和睪丸屏障。2-溴-4-氟乙酰苯胺在各組織樣品中的 tmax值均為0.5 h，表明其在組織中擴散分布非常迅速；24 h后在大部分組織中均已檢測不到該化合物，表明2-溴-4-氟乙酰苯胺總體上不蓄積。將血漿設為非靶向組織，計算各組織的靶向分配系數 (TDC)[17]，發現所有待測組織的TDC 值均小于1.0，提示2-溴-4-氟乙酰苯胺對組織無明顯的選擇性。

表1 2-溴-4-氟乙酰苯胺在大鼠血漿中的毒代動力學參數 (mean ± SD, n = 5)Table1 Toxicokinetics parameters of BFAA in rat plasma (mean ± SD, n = 5)

表2 不同染毒時間下大鼠各組織中2-溴-4-氟乙酰苯胺的含量 (mean ± SD, n = 5)Table2 Distribution of BFAA in rat tissues after administration (mean ± SD, n = 5)

2.4 大鼠對2-溴-4-氟乙酰苯胺的排泄狀況

表3 不同時間段大鼠尿液和糞便中2-溴-4-氟乙酰苯胺的排泄量 (mean ± SD，n = 5)Table3 Excretion of BFAA in rat urine and feces after administration during different time periods (mean ± SD，n = 5)

表4 大鼠尿液和糞便中2-溴-4-氟乙酰苯胺的累積排泄量及排泄率 (mean ± SD，n = 5)Table4 Amount and rate of cumulative excretion of BFAA in rat urine and feces (mean ± SD, n = 5)

SD 大鼠灌胃給予1 000 mg/kg 劑量的2-溴-4-氟乙酰苯胺，5 d 內其在各時間段尿液和糞便中的排泄情況見表3。結果顯示，該化合物在尿液和糞便內較在血液和組織中消除速度明顯減慢。24～48 h 時間段內其在尿液中的排泄量達到峰值(8.5 μg)，至120 h 尚有少量殘留；其在糞便中的排泄量同樣在24～48 h 時間段內達到峰值 (30.6 μg)，隨后下降，至72 h 后即無殘留。2-溴-4-氟乙酰苯胺經尿液和糞便的排泄主要發生在0～48 h 內，分別占總排泄量的93%和92%。表4 顯示了大鼠尿液和糞便中2-溴-4-氟乙酰苯胺的累積排泄量及排泄率情況，染毒后5 d，累積排泄量達到穩定，其中，經尿液排泄的2-溴-4-氟乙酰苯胺量為12.8 μg，經糞便排泄的量為67.9 μg，總計排泄量為80.6 μg，占總染毒量 (大鼠體重為271.4 ± 6.2 g) 的0.03%。2-溴-4-氟乙酰苯胺經尿液和糞便排泄率較低的原因可能與該藥物在大鼠體內存在廣泛的分解代謝有關，提示經尿液和糞便的排泄并非2-溴-4-氟乙酰苯胺母體化合物主要的體內消除途徑。

3 結論與討論

2-溴-4-氟乙酰苯胺是多種N-苯基酰胺類化合物合成的中間體，同時也是合成農藥時的重要雜質。2-溴-4-氟乙酰苯胺可在鈀催化劑作用下與多個化合物經多步反應獲得中間體3, 4-二氯-5-氟-2-聯苯乙酰胺，最后再經過?；磻频脙任詺⒕鷦┞摫竭辆穂18]。由于該合成方式產率較低，因此存在較多雜質，其可能的雜質包括2-溴-4-氟乙酰苯胺、N-(2-乙烯基-4-氟苯基) 乙酰胺、3, 4-二氯-5-氟-2-聯苯氨及3, 4-二氯-5-氟-2-聯苯乙酰胺等。也有文獻報道采用其他途徑合成聯苯吡菌胺，但產率均低于70%[6,19-20]。因此在采用聯苯吡菌胺防治谷類作物病害時，應對其雜質給予重點關注。

2-溴-4-氟乙酰苯胺作為關鍵的農藥中間體及最終產物的雜質，有必要就其對環境、動物和人類的毒性進行有效的安全性評估，但目前尚未見相關的毒理學和代謝過程研究報道。毒物動力學是整個毒理學評價的重要環節，在農藥的風險評估中起著非常重要的作用。毒物動力學試驗主要通過定量的方法來闡述化合物暴露和染毒劑量與時間之間的關系，可為化合物的各類毒性研究和評估提供劑量選擇依據[21-22]。

因此，為了闡明2-溴-4-氟乙酰苯胺在動物體內的代謝動力學，本研究對其在大鼠體內的血漿毒物動力學、組織分布以及經尿液和糞便的排泄情況進行了考察。結果表明：大鼠灌胃染毒后藥物可被迅速吸收，不同劑量下其血藥濃度達峰時間均不超過30 min，500 mg/kg 劑量以上則藥物吸收達到飽和，且血漿毒物動力學變化呈非線性動力學特征。2-溴-4-氟乙酰苯胺的生物利用度達到34.1%～83.3%，可能與引入的氟原子增強了藥物分子對生物膜的通透性有關。其血漿的藥-時曲線具有雙峰現象，推測其在動物體內可能存在重吸收或腸-肝循環[23]。同時該現象進一步解釋了2-溴-4-氟乙酰苯胺生物利用度相對較高的原因。2-溴-4-氟乙酰苯胺在大鼠組織中分布較廣且非?？焖伲o藥0.5 h 后即可達到濃度峰值，主要分布于小腸、胃和脂肪組織中。組織靶向分配系數結果顯示，2-溴-4-氟乙酰苯胺對動物組織無明顯的選擇性，與血漿中的情形類似，組織中也未出現化合物蓄積。此外，2-溴-4-氟乙酰苯胺可透過睪丸屏障和血腦屏障，這可能與其較高的脂溶性和較低的相對分子質量有關，該結果對進一步研究評估藥物的神經毒性和生殖毒性具有參考意義。研究還發現，2-溴-4-氟乙酰苯胺在尿液和糞便內較在血液和組織中消除明顯減慢，排泄主要集中在染毒后48 h 內，且其母體化合物經尿液和糞便的排泄率非常低。參考同類化合物N-(4-羥基苯基) 乙酰胺[24]、苯肽胺酸[17]及4-溴乙酰苯胺[25]，推測2-溴-4-氟乙酰苯胺在動物體內存在廣泛的代謝途徑，有可能主要通過去乙?；?、環羥基化、葡萄糖醛酸化或硫酸化等代謝方式排泄到體外。

有關2-溴-4-氟乙酰苯胺代謝產物的研究可通過動物體內提取的生物樣本進行酶水解，高效液相色譜-紫外 (HPLC-UV)、核磁共振 (NMR) 及質譜 (MS) 檢測結合同位素標記等多種手段進行分離和鑒定，同時還可通過體外肝代謝方法研究其代謝途徑和機制，如采用亞細胞片段、基因重組酶、肝細胞培養、肝組織切片及離體肝灌流等方法[26]進行研究。為全面闡明2-溴-4-氟乙酰苯胺的代謝動力學，后續在其代謝產物定性定量、代謝途徑及代謝機制等方面可進一步開展相關研究。