磁性分散固相萃取-QuEChERS 結合氣相色譜-串聯質譜法檢測不同柑橘基質中多種農藥殘留

楊 秦, 張耀海, 周 杰, 焦必寧

(1. 中國農業科學院/西南大學 柑桔研究所，農業農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶 400712；2. 農業農村部柑桔及苗木質量監督檢驗測試中心，重慶 400712)

農藥在柑橘生產過程中起著不可替代的作用，然而，不規范使用農藥導致柑橘中農藥殘留超標問題時有發生，影響環境安全、出口貿易以及消費者健康[1]。

目標農藥的提取、分離、凈化和濃縮等前處理技術是整個分析過程中的關鍵[2]。與傳統的QuEChERS 凈化劑相比，經磁性納米粒子 (MNPS)共聚結合的凈化劑比表面積大、擴散距離短，只需少量MNPS 吸附和較短平衡時間就能實現萃取分離，因此磁性分散固相萃取 (MDSPE) 具有更高的萃取能力和萃取效率[3]。將MDSPE 與QuEChERS相結合，能在更少的時間內完成目標物分析，并且能夠更好地減少樣品中的基質干擾。

關于柑橘中農藥多殘留檢測方法主要包括液相色譜法 (LC-MS)[4-5]、氣相色譜法 (GC-MS)[6-8]、氣相色譜-串聯質譜 (GC-MS/MS)[9-10]和液相色譜-串聯質譜法 (LC-MS/MS)[11-13]等，但鮮有利用基于Fe3O4-GCB-PSA-無水MgSO4共聚物的MDSPEQuEChERS 結合GC-MS/MS 分析不同柑橘基質中多種農藥殘留的報道，也未見不同農藥在不同柑橘品種中基質效應的系統研究。鑒于此，本研究采用Fe3O4-GCB-PSA-無水MgSO4共混物作為前處理凈化劑，結合GC-MS/MS，快速分析檢測了5 種代表性柑橘基質 (寬皮柑橘、甜橙、柚子、檸檬和金桔) 中的75 種農藥殘留，分析了不同農藥在不同柑橘品種中的基質效應，旨在更好地分析確證不同柑橘基質中的多種農藥殘留。

1 材料與方法

1.1 材料、藥劑與試劑

5 種柑橘：寬皮柑橘 (C. reticulata)(興津溫州蜜柑)，甜橙 (C. sinensis)(紐荷爾臍橙)，金桔 (C.fortunella)(滑皮金柑)，檸檬 (C. limion)(尤力克檸檬)，柚子 (C. grandis)(東風早)

藥劑與試劑：75 種農藥標準品見表1。乙腈(色譜純，美國Merck. Sigma-Aldrich 公司)；丙酮(色譜純，成都科隆化學有限公司)；無水硫酸鎂[分析純，重慶川東化工 (集團) 有限公司]；氯化鈉 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；N-丙基乙二胺 (PSA) 和石墨化碳黑 (GCB)(德國CNW Technologies GmbH 公司)；納米級四氧化三鐵(20 nm，球形，純度 ≥ 99.5%)(長沙晶康新材料科技有限公司)。

1.2 儀器與設備

島津GC-2030 和島津GC-MS TQ8040 NX(日本島津公司)；CL31/CL31R 多用途離心機 (美國Thermo Fisher 公司)；CK2000 型高通量組織研磨儀 (美國Thmorgan 生物科技有限公司)；WD-12 型水浴氮吹儀 (杭州奧盛儀器有限公司)。

1.3 分析方法

1.3.1 儀器檢測條件

色譜條件：色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS 石英毛細管柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序為60 ℃保持1 min，然后以40 ℃/min 升至180 ℃，再以8 ℃/min 升至280 ℃，保持8 min；平衡時間1 min；載氣為氦氣，流速1 mL/min，恒流模式；進樣口溫度 250 ℃；進樣量1 μL；不分流進樣。

質譜條件：電子電離源 (EI)，電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲時間為3 min；多反應監測 (MRM) 模式。

1.3.2 標準溶液配制 分別稱取75 種農藥標準品，用丙酮溶解，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，置于棕色試劑瓶中，于-18℃保存。分別移取適量的標準儲備液，以丙酮稀釋，配制成質量濃度為100 mg/L 的混合標準儲備液，于-18℃保存。待測定時根據需求以丙酮逐級稀釋成混合標準工作溶液，現配現用。

1.3.3 樣品制備 樣品的采集參考《農藥殘留分析樣本的采樣方法》[14]。用干凈紗布輕輕拭去柑橘樣品表面雜質，采用對角線分割法將全果等分為4 份，取對角部分切碎，勻漿，備用。

表1 75 種農藥標準品純度、保留時間及GC-MS/MS 的質譜條件Table1 Retention time of 75 pesticides and mass spectrometry conditions of GC-MS/MS

續表 1Table1 (Continued)

1.3.4 樣品前處理 稱取5 g (精確至± 0.01 g) 樣品，加入5 mL 乙腈，于1 000 r/min 下振蕩10 min，置于 -18 ℃冰箱靜置15 min (防止后續加入無水硫酸鎂和氯化鈉后過熱，影響熱不穩定性農藥的回收率[15])；加入2.0 g 無水硫酸鎂和0.5 g 氯化鈉，以1 000 r/min振蕩5 min，于10 000 r/min下離心5 min；取上清液1.5 mL，加入預先裝有30 mg MNPS、20 mg PSA、30 mg GCB 和100 mg 無水硫酸鎂的5 mL離心管中，渦旋1 min，使用磁鐵將凈化劑吸附于離心管壁，30 s 后吸取1 mL 上清液，于45 ℃水浴氮吹至近干，再用1 mL 丙酮復溶，渦旋混勻后過0.22 μm 濾膜，待GC-MS/MS 檢測分析。

2 結果與分析

2.1 定性和定量離子的選擇

通過全掃描 (Q3 Scan) 模式得到每種農藥的保留時間；選擇離子信號強的特征離子作為母離子，進行產物離子掃描，將目標農藥的母離子打碎，選擇響應值高的2 個或3 個離子作為子離子；選擇MRM 模式，碰撞能量范圍設置為2～40 eV，最終得到最佳碰撞能量。GC-MS/MS 系統可根據Smart 技術自動劃分時間段，不需要使用色譜分段法劃分時間段。圖1 為75 種農藥的總離子流圖，優化后的GC-MS/MS 的質譜條件見表1。

2.2 樣品前處理優化

2.2.1 GCB 用量的優化 GCB 對基質中的色素有很強的吸附能力，但其也容易吸附具有平面結構的農藥[16-17](如百菌清、敵敵畏、嘧霉胺等)。因此，本研究在75 種農藥中選擇14 種具有平面結構的代表性農藥，通過其回收率確定GCB 的最佳用量。

以溫州蜜柑為例，稱取5 g (精確至0.01 g) 樣品，固定無水MgSO4用量為100 mg，分別取GCB 用量為0、10、20、30、40 和50 mg，每處理重復3 次。向溫州蜜柑空白基質標準溶液中添加0.1 mg/kg的14 種農藥混合標準溶液。由圖2可以看出，敵敵畏、2,4,6-三氯苯酚、嘧霉胺、百菌清和烯唑醇5 種平面性較強的農藥的回收率隨著GCB 用量的增加而降低，其他9 種農藥受GCB 用量的影響不大；且當GCB 用量達到30 mg之后基質顏色變化不大，呈無色透明。因此，選擇GCB 的用量為30 mg。

2.2.2 PSA 用量的優化 PSA 具有兩個胺基，是一種強陰離子交換劑，能夠去除基質中的脂肪酸、酚酸、糖等酸性物質和部分極性色素，防止雜質聚積在進樣口、襯管和柱頭而產生基質效應[18-19]。因此，本研究探究了PSA 的添加量對農藥回收率的影響。

仍以溫州蜜柑為例，分別取PSA 用量為0、20、30、40 和50 mg，其他條件同2.2.1 節。由圖3可以看出，隨著PSA 用量的增加，農藥的回收率先升高后降低，其原因可能是因為PSA 含有胺基，會與酸性農藥發生反應，使得農藥響應值降低。當PSA 用量為20 mg 時，大部分農藥的回收率在70%～120%之間，符合《農作物中農藥殘留試驗準則》[20]要求。因此，選擇PSA 的用量為20 mg。

2.2.3 MNPS 用量的優化 本研究使用的MNPS 為20 nm 的Fe3O4，基于“物理共混”的方式[21]，MNPS與GCB、PSA 和無水MgSO4混合后，MNPS 被包裹到GCB、PSA 和無水MgSO4聚集形成的聚集團中，形成具有磁性的共混物[22-23]。待該共混物加入基質中渦旋1 min 后，外加磁場將共混物吸附在管壁便可吸取上清液，但必須有足夠的MNPS與GCB、PSA 和無水MgSO4形成共混物，才能夠確保GCB、PSA 和無水MgSO4能夠從基質中完全分離[7,24]。因此，本研究探究了MNPS 的最佳用量。

仍以溫州蜜柑為例，固定GCB、PSA 和無水MgSO4的用量分別為30 mg、20 mg 和100 mg，MNPS 的用量分別為0、20、30、40 和50 mg，每處理重復3 次。其他條件同2.2.1 節。由圖4 可知，隨著MNPS 用量增加，大部分農藥的回收率呈先升高后降低的趨勢，并于20 mg 時達到峰值，但據觀察20 mg 的MNPS 不能使GCB、PSA和無水MgSO4完全從基質中分離出來。因此，選擇MNPS 用量為30 mg。

2.3 MNPS 對凈化效果的影響

考察了添加MNPS 與否對凈化效果的影響。由圖5 可見，添加MNPS 后雜質峰響應值降低，而且雜質峰更少，該結果與Zheng 等[25]、LI 等[22]的結果相似，可見加入MNPS 對去除雜質具有積極的影響。

2.4 基質效應

柑橘種類繁多，鮮食品種主要為寬皮柑橘、甜橙、柚子、檸檬和金桔等，不同柑橘品種的基質具有顯著差異，基質效應的存在會增大測量誤差，影響方法靈敏度和準確度，最終影響農藥定性和定量結果[26-28]。

用丙酮分別配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 和0.5 mg/L 的農藥混合標準溶液，并用5 種空白基質配制相同濃度的基質匹配混合標準溶液，以基質匹配標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率計算基質效應 (Me)，Me小于1 屬于基質增強效應，大于1 屬于基質抑制效應[29]，結果見表2。由表2 可見，與溶劑標準溶液相比，75 種農藥殘留的響應值普遍顯著增強，這與柑橘復雜基質和儀器類型均有關。除檸檬與溫州蜜柑中的三氯殺螨醇和甲基谷硫磷，檸檬中的抗蚜威、硫環磷和聯苯肼酯以及甜橙中的異狄氏劑醛表現出較強的基質抑制效應外，其余基質中除目標化合物以外的其他成分在GC-MS/MS 上對目標化合物的響應值均具有增強效應，這可能是因為非目標化合物影響了待測化合物的氣化或者離子碎片化的效率[30]，以及部分化合物由于進樣口溫度過高易被分解，如異狄氏劑醛。5 種柑橘基質中，檸檬和金桔的基質效應普遍較高，這可能與檸檬和金桔的含水量低、黏度大、油胞較多和更為復雜的基質環境等有關，如金桔富含更獨特的營養功能成分[30]；75 種農藥中，久效磷 (14.9～28.55)、樂果 (12.09～16.26)、螺螨酯 (7.75～10.86) 和δ-六六六 (9.71～9.99) 的基質效應較高。因此，建議在檢測檸檬和金桔中的農藥殘留時，最好使用基質匹配標準溶液進行定

量分析。此外，該方法與QuEChERS 法[31]相比部分農藥的基質效應有所減弱。

表2 五種柑橘基質的基質效應、檢出限和定量限Table2 Matrix effects, LOD and LOQ of the five citrus matrices

續表 2Table2 (Continued)

2.5 方法評價

根據《農作物中農藥殘留試驗準則》[20]進行方法評價。向5 種柑橘基質空白樣品中添加75 種農藥標準品，大部分農藥的添加水平分別為0.01、0.05 和0.1 mg/kg，每個水平重復6 次，而敵敵畏在溫州蜜柑和金柑中，久效磷在溫州蜜柑、甜橙和金柑中，硫線磷在5 種柑橘中，硫環磷在檸檬中，炔螨特在溫州蜜柑、甜橙和金柑中，甲基谷硫磷在甜橙、柚子和金柑中的添加水平分別為0.02、0.05 和0.1 mg/kg，添加回收率測定結果如附加材料表1 所示。寬皮柑橘中平均回收率為65%～113%，RSD 為0.50%～14%；甜橙中平均回收率為60%～115%，RSD 為0.40%～14%；檸檬中平均回收率為6 3%～1 1 8%，R S D 為1.0%～16%；柚子中平均回收率為63%～106%，RSD為0.30%～13%；金桔中平均回收率為61%～117%，RSD 為0.30%～14%；均滿足農藥多殘留檢測要求。與其他4 種柑橘基質相比，金桔中的部分化合物回收率較低，這與金桔的含水量低、黏度大、樣品分散性小有關。

標準曲線線性范圍為0.01～0.5 mg/L，決定系數均大于0.99。檢出限 (LOD) 為3 倍信噪比時的濃度，定量限 (LOQ) 為10 倍信噪比時的濃度[32-33]。據此得出方法的LOD 為1～7 μg/kg，LOQ 為10～20 μg/kg；75 種農藥中，除敵敵畏、久效磷、硫線磷、硫環磷、甲基谷硫磷和炔螨特的LOD 和LOQ 較高外，其他農藥的LOD 均小于4 μg/kg，LOQ 均為10 μg/kg，證明該方法靈敏度較好。

2.6 實際樣品檢測

為了驗證該方法的實際應用能力，抽取柑橘主產地95 個樣品，采用所建立的方法進行檢測。結果顯示，其中75 個樣品有農藥殘留檢出，累計檢出18 種農藥，其中毒死蜱、丙溴磷、戊唑醇、苯硫威、氯氰菊酯、炔螨特、螺螨酯、噠螨靈、聯苯肼酯、氯氟氰菊酯及腈菌唑等11 種農藥檢出率較高，大于5%，這與實際生產調研結果[34-35]相符；一個臍橙樣品中，三唑磷和聯苯菊酯的殘留量均大于GB 2763—2019[36]中規定的最大殘留限量值 (分別為0.2 和0.05 mg/kg)。結果表明，本方法簡單、快速、準確、靈敏度高、重現性良好，與現有的文獻報道[33-34,37]和國家標準相比，無需第2 次離心，檢測成本較低 (約5 元/樣品)，同時可避免使用大量有機溶劑，減少了對環境的污染，因此可作為大批量多種柑橘鮮果樣品中多種農藥殘留的篩選和確證方法。

3 結論

本研究通過優化磁性分散固相萃取-QuEChERS前處理技術，結合氣相色譜-串聯質譜建立了快速檢測5 種柑橘基質中75 種農藥殘留的方法。該方法操作簡便快捷，能在較短時間內完成75 種農藥的殘留分析，具有準確度、精確度和靈敏度好等優點，適用于大批量不同品種柑橘中農藥的多殘留檢測。研究表明，5 種柑橘基質中，檸檬和金桔的基質效應普遍較高，因此建議應采用基質匹配標準溶液進行定量。