miR-664b-3p調控Caspase-1介導細胞焦亡在深靜脈血栓形成中的作用

褚楚，劉文，郭紅，趙霖，魏然，張振，郭強，朱肖肖，王彬，李霞

1 山東第一醫科大學基礎醫學院（基礎醫學研究所），濟南250062；2 山東德升生物工程有限公司；3 山東中醫藥大學附屬醫院

深靜脈血栓形成（DVT）是臨床常見的周圍血管疾病，因血液在深靜脈內不正常凝固導致靜脈回流障礙［1］。目前DVT 的發病機制尚不清楚，探討其發病機制對于尋找有效的防治措施具有重要意義。細胞焦亡是一種炎性程序性細胞死亡，由兩種半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）介導，包括經典的Cas?pase-1和非經典的Caspase-4/5/11。其中，Caspase-1可激活白細胞介素（IL）1β 和IL-18 前體產生成熟的IL-1β 和IL-18，同時裂解焦孔素D（GSDMD）形成具有成孔作用的活性片段GSDMD-N 以誘導細胞焦亡［2］。微小核糖核酸（miRNAs）通過與其靶基因3′非翻譯區（3′UTR）結合抑制基因轉錄或翻譯［3］。越來越多的研究表明，miRNAs 參與了DVT 的發生和發展，但其調控細胞焦亡在DVT 中的作用尚未見報道。2020 年2 月—10 月，我們通過檢測DVT 患者外周血細胞焦亡相關蛋白及miR-664b-3p 水平變化，探討miR-664b-3p 通過靶向調控Caspase-1 介導細胞焦亡在DVT 發病中的作用，為臨床治療DVT 提供新的靶點與依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2019 年1 月—2020 年1 月收治的急性期DVT 患者納入研究。納入標準：①符合第3 版《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》［4］中的診斷標準，屬于急性期混合型單純下肢DVT；②單側肢體發病，病程＜15 d；③年齡18～80 歲；④尚未采用溶栓等藥物治療。排除標準：①合并活動性下肢潰瘍；②合并心、腦、肺疾病及肝、腎功能異常；③有出血性疾病或出血傾向；④妊娠期婦女。本研究共收集DVT 患者30 例（DVT 組），男18 例、女12 例，年齡（56.8 ± 6.2）歲；選取同期健康志愿者30 例（健康對照組），男14例、女16例，年齡（54.8 ± 7.6）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經山東中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本采集與試劑準備 受試對象均于清晨空腹抽取靜脈血6 mL，分離血清用于ELISA 檢測，經人外周血淋巴細胞分離液分離單個核細胞（PBMC）用于qPCR 和Western blotting 檢測。實驗主要試劑：人外周血淋巴細胞分離液、RIPA 裂解液購于索萊寶科技有限公司；TRIzol Reagent、UItraSYBR Mixture均購于北京康為世紀生物科技公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 購于南京諾唯贊生物科技有限公司；293T 細胞購于南京科佰生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購于美國Invitrogen 公司；人IL-1β、IL-18 蛋白ELISA 試劑盒購自杭州聯科生物技術有限公司；miR-664b-3p mimics（上游序列為5′-UUCAUUUGCCUCCCAGCCUACA-3′，下游序列為5′-UAGGCUGGGAGGCAAAUGAAUU-3′）、陰性對照（NC，上游序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCAC?GUTT-3′，下 游 序 列 為5′-ACGUGACACGUUCG?GAGAATT-3′）及miR-664b-3p、內參U6 引物由上海吉瑪公司設計合成，引物序列見表1；Caspase-1 抗體、GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；GSDMD-N 抗體購于美國Novus Biologicals 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 抗體購于北京中杉金橋公司；野生型與突變型Caspase-1 3′UTR 載體均由美國Promega公司設計合成。

表1 miR-664b-3p、U6基因引物序列及產物片段

1.3 PBMC 中活化的Caspase-1（Cleaved Caspase-1）、GSDMD-N及miR-513c-5p檢測

1.3.1 Cleaved Caspase-1、GSDMD-N 蛋白檢測 采用Western blotting 法。 用RIPA 裂解液提取各組PBMC 總蛋白，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜；1×PBST 洗膜（10 min×4 次），二抗室溫搖床孵育1 h；1×PBST 洗膜（10 min×4 次），加入顯影液顯影，化學發光法染色；Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與GAPDH灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

1.3.2 miR-664b-3p 檢 測 采 用qPCR 法。 用TRIzol 法進行提取各組PBMC 中的RNA，紫外分光光度儀測定RNA 濃度與純度。 按照miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行miRNA 的cD?NA 合成，選用UltraSYBR Mixture PCR 反應體系進行PCR擴增，以2－ΔΔCt計算miR-664b-3p相對表達量。

1.4 血清IL-1β、IL-18 蛋白檢測 取離心所得血清，以ELISA 法檢測IL-1β、IL-18 蛋白，按照試劑盒說明書操作。使用酶標儀測定雙波長（450 nm、630 nm）處的光密度（OD）值，依據標準品OD 值繪制標準曲線，計算IL-1β、IL-18蛋白水平。

1.5 miR-664b-3p 與Caspase-1 的關系預測 采用Target Scan7.2 生物信息學軟件，預測miR-664b-3p與Caspase-1 mRNA 3′UTR 之間是否存在直接結合位點。

1.6 miR-664b-3p 靶向調控Caspase-1 情況觀察以pmirGLO為載體構建包含結合位點的野生型及突變型Caspase-1 mRNA 3′UTR 質粒，然后轉染293T細胞，同時分別轉染miR-664b-3p mimics 及NC，24 h后收集細胞并檢測雙熒光素酶報告基因活性。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism7.0 統計軟件。計數資料以表示，兩組數據比較行配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組PBMC 中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N 蛋白及miR-664b-3p表達水平比較 由表2可見，DVT組較健康對照組PBMC中Cleaved-Caspase-1、GSDMD-N蛋白表達升高而miR-664b-3p表達降低（P均＜0.05）。

表2 兩組PBMC中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白及miR-664b-3p表達比較（）

表2 兩組PBMC中Cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白及miR-664b-3p表達比較（）

注：與健康對照組相比，*P＜0.05；

組別DVT組健康對照組n 30 30 Cleaved Caspase-1 2.04 ± 0.11*1.00 ± 0.04 miR-664b-3 0.67 ± 0.05*1.02 ± 0.08 GSDMD-N 2.37 ± 0.05*0.99 ± 0.05

2.2 miR-664b-3p 與Caspase-1 關系的生物信息學預測結果 miR-664b-3p 與Caspase-1 mRNA 3′UTR之間具有潛在的互補結合位點，提示miR-664b-3p可能通過結合Caspase-1 mRNA 的3′UTR 進而抑制其表達。

2.3 miR-664b-3p 對Caspase-1 mRNA 3′UTR 熒光素酶報告基因活性的影響 由表3 可見，轉染miR-664b-3p mimics 可以降低野生型Caspase-1 mRNA 3′UTR 熒光素酶報告基因活性（P＜0.05），但對突變型Caspase-1 mRNA 3′UTR 報告基因活性無顯著影響（P＞0.05）。

表3 miR-664b-3p對Caspase-1 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性的影響（）

表3 miR-664b-3p對Caspase-1 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性的影響（）

注：與轉染NC的細胞相比，*P＜0.05。

轉染物Caspase-1 mRNA 3′UTR熒光素酶報告基因活性野生型0.74 ± 0.00*1.00 ± 0.04 miR-664b-3p mimics NC突變型1.00 ± 0.08 0.99 ± 0.03

2.4 兩組血清IL-1β、IL-18 蛋白水平比較 由表4可見，DVT 組較健康對照組外周血IL-1β 及IL-18 蛋白水平升高（P均＜0.05）。

表4 兩組血清IL-1β、IL-18蛋白水平比較（）

表4 兩組血清IL-1β、IL-18蛋白水平比較（）

注：與健康對照組相比，*P＜0.05。

組別健康對照組DVT組IL-18 123.00 ± 15.55 526.00 ± 16.03*n 30 30 IL-1β 1.45 ± 0.13 5.56 ± 0.17*

3 討論

DVT 是因靜脈壁損傷、靜脈血流滯緩、血液高凝狀態引起的周圍血管疾病，其急性期導致的肺栓塞及慢性期血栓形成后的綜合征嚴重危害患者生命安全及生活質量［5］。因此，DVT 的發病機制具有重要的研究意義。內皮細胞損傷和功能障礙是DVT發生的重要因素，然而導致血管內皮細胞損傷的機制尚未完全闡明。

細胞焦亡是一種炎性程序性細胞死亡，其特征是GSDMD 介導的細胞膜腫脹破裂和IL-1β、IL-18引起的炎癥反應［6］。當炎癥小體被激活時，Caspase-1和其他非經典Caspase 將其GSDMD 切割成N-端和C-端，從而破壞蛋白之間的抑制作用。游離的GSD?MD-N 末端能夠與質膜結合，并在細胞膜上產生內徑12～14 nm 的孔隙，導致細胞腫脹、裂解，并成為釋放炎癥因子（如IL-1β、IL-18）的通道［7］。炎癥反應是區別細胞焦亡與細胞凋亡的重要標志。適當的細胞焦亡及炎癥反應對于阻斷病原體復制、直接殺滅胞內菌及維持機體內環境穩定具有重要作用，但細胞焦亡不足或過度將導致細胞增殖失控或組織損傷，引起疾病的發生和發展［8］。研究發現，細胞焦亡減少可導致腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移能力增強，而細胞焦亡過度導致的組織損傷參與了動脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病等疾病的病理過程［9-10］。然而，目前細胞焦亡在靜脈血栓性疾病中的作用和調控機制尚未見報道。本研究發現，DVT 患者外周血細胞焦亡相關蛋白Cleaved Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、IL-18表達均上調，提示Caspase-1介導的細胞焦亡引起內皮細胞損傷參與了DVT 的發病。探索DVT 發病過程中細胞焦亡的調控機制，可能為DVT 的臨床治療提供新的有效靶點。

miRNAs 是非編碼RNA 領域研究的熱點。越來越多的證據表明，miRNAs 參與細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導等生理過程的調控，以及多種疾病的發生發展［11］。近年來，miRNAs 在血管內皮損傷和DVT 發展中的作用越來越受到重視。研究發現，miR-195-5p表達升高，促進血管內皮細胞凋亡，從而參與DVT 發病［12］。我們前期研究發現，miR-338-5p表達降低導致的IL-6 表達升高，以及miR-374a-5p、miR-374b-5p 表達升高導致的IL-10 表達降低，均與DVT 的發生發展有關［13-14］。同時，有研究發現miR?NAs 對細胞焦亡有調節作用。例如，miR-590-3p 通過靶向NLRP1/NOX4 信號通路抑制細胞焦亡從而減輕糖尿病視網膜病變［15］；miR-214 可通過抑制Caspase-1 介導的細胞焦亡，抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移［16］。盡管已有上述發現，但miRNAs 影響細胞焦亡在DVT發病中的作用仍不清楚。

有研究報道，miR-664b-3p 參與了喉鱗狀細胞癌、胰腺癌等腫瘤發生發展［17］。本研究發現，DVT組患者外周血PBMC 中miR-664b-3p 表達較健康對照組降低，細胞焦亡相關蛋白Cleaved Caspase-1、GSDMD-N 及IL-1β、IL-18 蛋白表達升高。生物信息軟件Target Scan預測顯示，miR-664b-3p與Caspase-1 mRNA 的3′UTR 之間存在潛在堿基互補結合位點。雙熒光素酶報告基因系統證實，miR-664b-3p能夠與Caspase-1 mRNA 3′UTR 之間通過堿基互補配對直接結合，進而抑制Caspase-1的轉錄與翻譯。以上結果提示，miR-664b-3p表達降低能夠解除其對靶基因Caspase-1表達的抑制，Caspase-1活性增強可通過切割GSDMD形成有活性的N片段，進而在細胞膜上形成孔道，導致細胞焦亡及炎癥因子釋放，損傷血管內皮功能，最終導致DVT。

總之，本研究進一步闡釋了DVT 的發病機制，提示miR-664b-3p調控Caspase-1介導的細胞焦亡參與了DVT 的發生發展；因此，靶向上調miR-664b-3p表達以抑制Caspase-1及血管內皮細胞焦亡、保護血管內皮功能可能成為臨床治療DVT新的有效方式。