γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch通路并糾正腦卒中后抑郁大鼠Th17/Treg失衡*

李 靜， 尉 娜， 劉亞美， 蘇 靜， 宋景貴

（1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南衛(wèi)輝453100；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453002）

腦卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）是腦卒中中一種常見神經(jīng)精神并發(fā)癥[1]，目前發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能包括生物學(xué)和心理學(xué)等多方面因素[2]。隨著抑郁癥細(xì)胞因子假說的提出，研究認(rèn)為，抑郁可能與免疫學(xué)缺陷有關(guān)[3-4]。輔助性T 細(xì)胞（help T cell，Th）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）均是CD4+T 細(xì)胞不同亞群，Th17 細(xì)胞可特異性分泌細(xì)胞炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病，而Treg 細(xì)胞具有免疫抑制作用，可維持自身免疫耐受，Th17/Treg比例失衡與抑郁癥、卒中后疲勞等疾病密切相關(guān)[5-6]。Notch 信號(hào)通路不僅與細(xì)胞增殖分化凋亡有關(guān)，還具有免疫調(diào)節(jié)功能。研究證實(shí)，γ-分泌酶抑制劑DAPT｛N-[N-（3，5-difluorophenylacetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycinet-butyl ester｝是Notch 信 號(hào)通路有效阻斷劑，在慢性丙型肝炎和過敏性哮喘等疾病中發(fā)揮調(diào)節(jié)Th17/Treg 平衡的作用[7-8]，但DAPT是否亦通過阻斷Notch 信號(hào)通路調(diào)控Th17/Treg 平衡而參與PSD 尚未可知。因此，本研究擬通過建立PSD 大鼠模型，探究DAPT 調(diào)控Th17/Treg 平衡參與PSD 的作用機(jī)制，以期為闡明PSD 發(fā)生機(jī)制提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠33只，7 周齡，體重220～250 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0007。大鼠于12 h/12 h 光照/黑暗、室溫（22±2）℃環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

2 藥物和試劑

大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）線栓（型號(hào)：403556PK5Re）購自Doccol；DAPT（貨號(hào)：D5942，HPLC≥98%）購自Sigma-Aldrich；RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：DP419）購自天根生化科技（北京）有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（realtime quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（貨號(hào)：D7268S）購自上海碧云天生物科技有限公司；白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：ab214028）、IL-10 ELISA 試劑盒（貨號(hào)：ab214566）、兔源Ⅰ抗[anti-Notch1（貨號(hào)：ab52627）、anti-Hes1（貨號(hào)：ab108937）、anti-β-actin（貨號(hào)：ab179467）、anti-CD4（貨號(hào)：ab237722）和anti-Foxp3（貨號(hào)：ab215206）]及Ⅱ抗羊抗兔IgG（貨號(hào)：ab6721）均購自Abcam。

3 主要儀器

Model 550 型酶標(biāo)儀購自Bio-Rad；7500 型RTqPCR 儀、Evolution 220 型紫外分光光度計(jì)、Forma Steri-Cycle i160 CO2培養(yǎng)箱購自Thermo Fisher；IX73熒光顯微鏡購自O(shè)lymplus；FACSCalibur 流式細(xì)胞儀購自Becton Dikinson。

4 方法

4.1 PSD 大鼠模型建立 根據(jù)敞箱實(shí)驗(yàn)（open-field test，OFT）及蔗糖偏愛實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）測(cè)定大鼠基線評(píng)分，篩選符合條件的33 只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)（sham）組（n=10）和手術(shù)組（n=23）。手術(shù)組大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛腹腔麻醉，參照文獻(xiàn)[9]首先采用線栓法建立局灶性MCAO大鼠模型，術(shù)中插入栓線深度為（18±1）mm。術(shù)后24 h 參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）刺激，大鼠在第1～15天分別進(jìn)行禁食禁飲20 h、持續(xù)照明17 h、4℃強(qiáng)迫游泳5 min、45°傾斜籠17 h、禁飲17 h、濕籠21 h、水平震蕩鼠籠5 min、夾尾1 min、行為約束2 h、禁食禁飲20 h、持續(xù)照明17 h、4℃強(qiáng)迫游泳5 min、45°傾斜籠17 h、禁飲17 h 處理、濕籠21 h；術(shù)中死亡3 只，成模大鼠20 只，成功率86.96%，隨機(jī)分為PSD組和DAPT 組，每組各10 只。DAPT 組于MCAO 術(shù)后2 d 進(jìn)行CUMS 刺激結(jié)合孤養(yǎng)，于第15 天皮下注射DAPT（5 mg/kg[11]），干預(yù)2 周；sham 組大鼠進(jìn)行開顱手術(shù)但不阻斷大腦中動(dòng)脈，sham 組和PSD 組大鼠皮下注射等量生理鹽水進(jìn)行同等時(shí)間干預(yù)。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：造模24 h 內(nèi)出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺陷；CUMS 刺激2 周后出現(xiàn)體重減輕、活動(dòng)減少、蜷縮少動(dòng)、興趣感下降等抑郁樣癥狀。

4.2 體重及行為學(xué)檢測(cè) 各組大鼠于術(shù)前（0 d）及術(shù)后7、14、21 和28 d 分別進(jìn)行體重檢測(cè)、OFT 及SPT。（1）OFT：制備80 cm×80 cm×40 cm敞箱，壁周為黑色，底面用黑線劃分為25 塊面積相等的小塊，記錄5 min 內(nèi)大鼠穿越底面方塊數(shù)的水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分，及以直立（兩前肢離地超過1 cm）次數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)的垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分；（2）SPT：參考曲淼等[3]的方法進(jìn)行改進(jìn)，給予1%蔗糖水飼養(yǎng)48 h，禁水4 h 后暴露于兩個(gè)外觀完全相同的瓶子（1 個(gè)盛滿1%蔗糖水，另1 個(gè)盛滿普通飲用水）1 h，測(cè)定大鼠糖水消耗體積與總消耗水體積比值。

4.3 海馬Notch1 和Hes1 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 開顱取腦，分離海馬組織，置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｌ崛「鹘M5 只大鼠海馬組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎肦T-qPCR 擴(kuò)增Notch1 和Hes1 mRNA 片段。20 μL 反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA（50 mg/L）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40個(gè)循環(huán)。Notch1上游引物序列（5′→3′）為GCTGACCTGCGCATGTCTGCCATG，下 游 引 物 序 列（5′→3′）為CATGTTGTCCTGGATGTTGGCATCTG；Hes1 上游引物序列（5′→3′）為GCACAGAAAGTCATCAAAGCCTATT，下游引物序列（5′→3′）為GCTATCTTTCTTCAGAGCATCCAA；內(nèi)參照GAPDH 上游引物序列（5′→3′）為GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT，下游引物序列（5′→3′）為TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC。采用2-ΔΔCt法定量分析Notch1 和Hes1 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

4.4 海馬Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 檢測(cè)各組剩余5 只大鼠海馬組織Notch1和Hes1 蛋白表達(dá)。蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，依次進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別添加Ⅰ抗[anti-Notch1（1∶2 000）、anti-Hes1（1∶1 000）和anti-β-actin（1∶2 000）]，4℃孵育過夜，添加Ⅰ抗IgG（1∶5 000）室溫避光孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)法顯影，蛋白條帶灰度值用ImageJ軟件分析。

4.5 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中Th17和Treg細(xì)胞比例檢測(cè) 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠麻醉處死，采集4 mL 腹主動(dòng)脈血于肝素鈉采血管中抗凝，添加淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，RPMI-1640 培養(yǎng)基洗滌2 次后調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/L。取100 mL，添加0.5 mL 佛波酯及0.5 mL 莫能菌素，混勻后于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。細(xì)胞懸液混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管中添加0.5 mL CD4，4℃孵育30 min后，離心棄上清，PBS重懸細(xì)胞后分別添加PE-IL-17 抗體0.625 mL 和PEFoxp3 抗體5 mL，對(duì)照組分別加入同型PE-IgG2a 0.625 mL 和55 mL，4℃避光孵育30 min 后，上流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞比例。

4.6 血清IL-17 和IL-10 水平測(cè)定 外周血常規(guī)離心后分離血清，采用ELISA 檢測(cè)各組大鼠血清IL-17和IL-10 水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 DAPT對(duì)PSD大鼠體重的影響

隨著時(shí)間從延長，sham 組大鼠體重逐漸增加，而PSD組和DAPT組大鼠體重呈先降低后增加趨勢(shì)；在0 d，各組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在7、14、21 和28 d，與sham 組比較，PSD 組大鼠體重均顯著降低（P＜0.05）；在7 和14 d，PSD 組和DAPT組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在21和28 d，與PSD 組比較，DAPT 組大鼠體重顯著增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Effect of DAPT on the body weight of PSD rats. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖1 DAPT對(duì)PSD大鼠體重的影響

2 DAPT對(duì)PSD大鼠OFT結(jié)果的影響

各組大鼠0 d 基線水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在7、14、21 和28 d，與sham 組比較，PSD 組大鼠水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分均顯著降低（P＜0.05）；在和14 d，PSD 組與DAPT 組大鼠水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在21 和28 d，與PSD 組比較，DAPT 組大鼠水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分顯著升高（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. Effect of DAPT on the motor score of PSD rats in open-field test. A：horizontal motor score；B：vertical motor score. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖2 DAPT對(duì)PSD大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)中運(yùn)動(dòng)評(píng)分的影響

3 DAPT對(duì)PSD大鼠糖水消耗比例的影響

各組大鼠0 d 糖水消耗比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在7、14、21 和28 d，與sham 組比較，PSD組大鼠糖水消耗比例均顯著降低（P＜0.05）；在7 和14 d，PSD 組與DAPT 組大鼠糖水消耗比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在21 和28 d，與PSD 組比較，DAPT 組大鼠糖水消耗比例顯著增加（P＜0.05），見圖3。

4 DAPT 對(duì)PSD 大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 mRNA表達(dá)的影響

與sham 組比較，PSD 組大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與PSD 組比較，DAPT 組大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 3. Effect of DAPT on sugar water consumption ratio in PSD rats. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖3 DAPT對(duì)PSD大鼠糖水消耗比例的影響

Figure 4. Effect of DAPT on Notch1 and Hes1 mRNA expression in hippocampal tissues of PSD rats. Mean±SD.n=5. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖4 DAPT 對(duì)PSD 大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 mRNA 表達(dá)的影響

5 DAPT 對(duì)PSD 大鼠海馬組織Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的影響

與sham 組比較，PSD 組大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與PSD 組比較，DAPT 組大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. Effect of DAPT on Notch1 and Hes1 protein expression in hippocampal tissues of PSD rats. Mean±SD.n=5. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖5 DAPT 對(duì)PSD 大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 蛋白表達(dá)的影響

6 DAPT 對(duì)PSD 大鼠PBMC 中Th17 和Treg 細(xì) 胞比例的影響

與sham 組比較，PSD 組大鼠PBMC 中Th17 細(xì)胞比例和Th17/Treg 比值顯著升高，Treg 細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05）；與PSD 組比較，DAPT 組大鼠PBMC中Th17 細(xì)胞比例和Th17/Treg 比值顯著降低，Treg細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.05），見圖6。

7 DAPT 對(duì)PSD 大鼠血清IL-17 和IL-10 水平的影響

與sham 組比較，PSD 組大鼠血清IL-17 水平顯著升高，IL-10 水平顯著降低（P＜0.05）；與PSD 組比較，DAPT 組大鼠血清IL-17 水平顯著降低，IL-10 水平顯著升高（P＜0.05），見圖7。

討論

PSD 是卒中后腦部特定功能結(jié)構(gòu)損傷，尤其是左側(cè)額葉、顳葉、基底節(jié)、丘腦部位病變等，及各種心理和社會(huì)應(yīng)激的共同作用結(jié)果[12]。研究顯示，嚙齒類動(dòng)物在經(jīng)歷一系列CUMS 應(yīng)激后可出現(xiàn)活動(dòng)減少、興趣下降、快感缺失等抑郁樣行為[13]，因此本研究首先采用MCAO 術(shù)制備缺血性腦卒中SD 大鼠模型，再聯(lián)合CUMS 及孤養(yǎng)法模擬卒中后負(fù)壓力環(huán)境制備PSD 大鼠模型。結(jié)果顯示，與sham 組比較，PSD 組大鼠隨觀察時(shí)間延長，體重呈先降低后緩慢增加趨勢(shì)，可能與大鼠情感抑郁和食欲下降有關(guān)，也可能與應(yīng)激過程禁食禁水等直接刺激有關(guān)，提示體重減輕可能直接反映應(yīng)激對(duì)大鼠帶來嚴(yán)重負(fù)面影響。而且OFT 中水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分依次降低。OFT 是一種反映大鼠探索能力及情緒反應(yīng)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，大鼠水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分和垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分降低可反映大鼠存在興趣下降、探索能力降低等抑郁癥狀。正常大鼠對(duì)甜味有偏好，而本研究結(jié)果顯示PSD 組大鼠糖水消耗量比例降低，提示PSD 大鼠存在快感缺失癥狀，與Tao等[14]文獻(xiàn)報(bào)道一致。綜合以上結(jié)果提示，PSD模型制備成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 6. Effect of DAPT on the proportions of Th17 and Treg cells in PBMC of PSD rats. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖6 DAPT對(duì)PSD大鼠PBMC中Th17和Treg細(xì)胞比例的影響

Figure 7. Effect of DAPT on serum IL-17 and IL-10 levels in PSD rats. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs PSD group.圖7 DAPT對(duì)PSD大鼠血清IL-17和IL-10水平的影響

DAPT 間接影響Notch 活化，進(jìn)而影響細(xì)胞信號(hào)通路作用。Notch 通路是由一類在進(jìn)化過程中高度保守的表面受體基因組成，可通過細(xì)胞間信號(hào)傳遞作用參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程。Notch 信號(hào)通路中Notch1 及其下游靶分子Hes1 表達(dá)上調(diào)不僅可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化釋放促炎因子，還可通過與不同配體結(jié)合調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞分化參與炎癥反應(yīng)[15-16]。Treg 及Th17 不僅在分化上存在聯(lián)系，而且可相互轉(zhuǎn)化，Th17 細(xì)胞主要分泌IL-17 和IL-6 等促炎細(xì)胞因子，Treg 細(xì)胞可分泌IL-10 和TGF-β 等，而Th17分化依賴TGF-β水平[17-18]。研究顯示，Th17/Treg 細(xì)胞失衡 與Notch1 表 達(dá) 增加有 關(guān)[8]，而阻 斷Notch 信號(hào)通路可通過抑制Treg 細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞平衡，減輕大鼠肝纖維化[19]，還可通過抑制促炎因子釋放改善動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中[11]。本研究結(jié)果顯示，與sham 組比較，PSD 組大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 的mRNA 及蛋白水平，以及PBMC 中Th17 細(xì)胞比例和Th17/Treg 比值均顯著升高，Treg 細(xì)胞比例降低，提示PSD 大鼠存在Th17/Treg 細(xì)胞平衡紊亂及Notch 信號(hào)通路激活。Notch 信號(hào)通路中配體與受體結(jié)合后經(jīng)γ-分泌酶進(jìn)行組成型酶切，激活相關(guān)基因表達(dá)，而DAPT 可抑制γ-分泌酶活性，間接阻斷Notch 信號(hào)通路激活[20]。本研究亦采用DAPT 阻斷Notch 信號(hào)通路，結(jié)果顯示，與PSD 組比較，DAPT 組大鼠海馬組織Notch1 和Hes1 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著降低，PBMC 中Th17 細(xì)胞比例、Th17/Treg 比值及血清IL-17 水平降低，Treg細(xì)胞比例和血清IL-10 水平增加，大鼠體重、OFT 實(shí)驗(yàn)中水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分、垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分及糖水消耗比例均顯著增加，提示DAPT 阻斷Notch 信號(hào)通路可能通過調(diào)控Th17/Treg 平衡減輕PSD 炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)其自身免疫，從而減輕PSD大鼠抑郁樣癥狀。

綜上所述，DAPT 可減輕PSD 大鼠抑郁樣癥狀，其機(jī)制可能是通過阻斷Notch 信號(hào)通路進(jìn)而緩解Th17/Treg失衡及炎癥因子分泌。但本研究指標(biāo)從大鼠行為上反映抑郁行為，主觀性較強(qiáng)，使結(jié)果有一定偏倚，針對(duì)PSD 大鼠抑郁的更多客觀性評(píng)價(jià)指標(biāo)及具體作用機(jī)制有待深入探究。