Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶在小鼠血管平滑肌細胞增殖和遷移中的作用機制研究*

谷 敏， 馮菲菲， 甘雪晴， 李 霜， 孫雄山△， 楊大春，△

（1西南交通大學醫學院，四川成都610031；2西部戰區總醫院心內科，四川成都610083）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是全球范圍內第一位致死、致殘原因[1]。冠狀動脈、頸動脈和其他外周動脈粥樣硬化作為常見的血管疾病，經皮介入治療是重要的干預手段。血管再狹窄是血管介入治療的主要并發癥，會導致嚴重心血管不良事件，同時也限制了支架的效用[2]。在血管再狹窄的發生發展過程中，首先是血管內皮受到機械性損傷，隨后活化的血小板和炎癥細胞聚集在受損區域并分泌多種細胞因子，如血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和白細胞介素6等，這些生長因子和炎癥介質會促進血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖和遷移，從而導致新生內膜增生和再狹窄[3]。目前，血管再狹窄的分子調控機制主要包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB/AKT）等[4]，但針對這些機制的防治措施仍不能完全遏制再狹窄的發生。因此，揭示再狹窄的潛在機制和尋找新的治療靶點是亟待解決的問題。

Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶（phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase type III，PIKfyve）是一種進化上相對保守的脂質激酶，可以催化其相應的底物合成磷脂酰肌醇5-磷酸（phosphatidylinositol 5-phosphate，PtdIns5P）和磷脂酰肌醇3，5-二磷酸（phosphatidylinositol 3，5-bisphosphate，PtdIns3，5P2）[5]。PIKfyve在哺乳動物心臟、血管、腦、骨骼肌和脂肪等組織表達豐富，最近多項研究顯示PIKfyve 在血管鈣化和心肌肥厚等心血管疾病中也發揮重要作用[6-7]。VSMC作為血管壁的主要構分，其在病理刺激下過度增殖和遷移在血管內膜增生和再狹窄中發揮重要作用[8]。有研究表明，抑制PIKfyve可以降低肝癌細胞、淋巴瘤細胞、成纖維細胞等的增殖和遷移[9-11]，但是PIKfyve 在VSMC 增殖、遷移及血管內膜增生中的作用目前并不清楚。本實驗使用PDGF-BB 干預VSMC誘導體外增殖和遷移，并且構建小鼠頸動脈內皮損傷模型[12]，探討PIKfyve 對VSMC 增殖和遷移及血管內膜增生的影響，以期為血管再狹窄的治療提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 動物和細胞 8～10 周齡SPF 級C57BL/6J 雄性野生型小鼠50只，體重25 g左右，購自成都達碩生物有限公司，許可證號：SCXK（川）2020-030。日夜規律光照各12 h，自由攝入水和食物，飼養室內保持恒溫22～25℃。使用酶消化分離法從8～10 周小鼠胸主動脈中分離出VSMC。

1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養液及0.25%胰蛋白酶（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；HE 染色試劑盒（Solarbio）；RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒及SYBR（TaKaRa）；qPCR 引物由成都擎科偉業生物技術有限公司合成；PIKfyve 抑制劑YM201636（MCE）；PIKfyve 抗體（Santa Cruz）；PIKfyvesiRNA 由廣州銳博生物公司合成；GAPDH、核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，S6）、磷酸化（phospho，p）-S6Ser235/236、4E 結 合 蛋 白1（4E-binding protein 1，4EBP1）和p-4EBP1Thr37/46抗體（Cell Signaling Technology）；Ki-67抗體（Bioss）；山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗鼠Ⅱ抗（Solarbio）；PDGF-BB（PeproTech）；ECL 發光液（Millipore）；重組人胰島素（Solarbio）。

2 實驗方法

2.1 小鼠VSMC 的培養及分組 用酶消化分離法從8～10 周小鼠胸主動脈中分離出VSMC，用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養液培養，置于5% CO2、37℃培養箱中孵育。隨后每2 d 更換培養液，待細胞生長融合至約90%時，用0.25%胰酶消化后按照1∶2 或1∶3 傳代培養。選擇處于對數生長期的細胞進行實驗。用PDGF-BB 干預VSMC 誘導體外的增殖和遷移，用PIKfyve特異性siRNA 敲減PIKfyve的表達，用PIKfyve 抑制劑YM201636 抑制PIKfyve 活性，用胰島素激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）的活性。為觀察敲減PIKfyve表達對VSMC 增殖和遷移的影響，將VSMC 分為DMSO+siCon 組、PDGF-BB+siCon 組、DMSO+siPIKfyve 組和PDGF-BB+siPIKfyve組，各組在成功轉染對照siRNA 載體或者PIKfyvesiRNA 后加入PDGF-BB（30 μg/L）或者DMSO 干預24 h。為觀察抑制PIKfyve 活性對VSMC 增殖和遷移的 影 響，將VSMC 分 為DMSO 組、PDGF-BB 組、YM201636 組和PDGF-BB+YM201636 組，按 分組加入YM201636（1 μmol/L）或DMSO 預孵育12 h，再加入PDGF-BB 或DMSO 共孵育24 h。為進一步研究PIKfyve 通過影響mTORC1 活性調控VSMC 增殖和遷移，在敲減PIKfyve表達或抑制其活性的基礎上，加入胰島素（5 mg/L）孵育24 h。

2.2 細胞PIKfyvesiRNA 轉染 將細胞懸液鋪于孔板中，細胞生長至大約40%時候按照試劑使用說明用Lipofectamine 2000 作為轉染試劑以50 nmol/L 濃度進行PIKfyvesiRNA 或對照載體轉染，每組設3 個復孔。PIKfyvesiRNA序列：5"-GUUGUCAAUGGCUUUGUUU-3"和5"-AAACAAAGCCAUUGACAAC-3"[6]。

2.3 Ki-67免疫熒光染色檢測細胞增殖 在24孔板中放入爬片，加入細胞懸液，按前述分組干預完成后倒掉培養液，用PBS浸洗爬片3次，4%多聚甲醛固定30 min 以上，PBS 洗3 次，0.3%～0.5%的TritonX-100室溫通透15 min，PBS 洗3 次，吸水紙吸干，山羊血清室溫封閉30 min，吸水紙吸掉封閉液，每張玻片滴加足量的Ⅰ抗并放入濕盒中4℃過夜。之后PBS洗滌3次，滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗（此后在暗室操作），濕盒37℃孵育1 h，滴加DAPI復染核5 min，PBS洗掉多余的DAPI，吸水紙吸干液體后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下采集圖像。

2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移 用記號筆在6 孔板背后均勻地劃橫線，大約每隔0.5～1 cm一道，每孔有5 條橫線穿過。于6 孔板中鋪細胞，待細胞鋪滿后用無菌10 μL 吸頭垂直于橫線劃一條痕。用PBS 洗細胞3 次，洗去多余懸浮細胞，拍攝0 h 照片。加入無血清培養液，按實驗要求進行干預，放入孵育箱中培養，24 h后在光學顯微鏡下拍照。

2.5 qPCR 檢測PIKfyve mRNA 表達水平 用RNA提取試劑盒，并根據說明書提取VSMC 的總RNA。標準化各組RNA 濃度，反轉錄為cDNA 后進行擴增，以GAPDH 為內參照，用2-ΔΔCt法計算PIKfyv 的相對表達量。PIKfyv 的上游引物序列為5"-ATGGCCACAGATGACAAGAGTTCC-3"，下游引物序列為5"-CAGACTGTGTTCTTGAAGGG-3"[6]；GAPDH 的 上 游引物序列為5"-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3"，下游引物序列為5"-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3"。

2.6 Western blot 檢測細胞PIKfyve 表達和反映mTORC1 活性的靶分子S6（Ser235/236）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化水平 提取血管或VSMC 蛋白，按照蛋白提取試劑盒說明書進行。測定蛋白濃度，取蛋白樣品行SDS-PAGE 分離，然后轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉或胎牛血清中室溫封閉1 h。加入相 應 的Ⅰ抗（PIKfyve、S6、p-S6Ser235/236、4EBP1、p-4EBP1Thr37/46和GAPDH 抗體，均按1∶1 000 稀釋），于4℃過夜孵育。次日TBST洗膜后再用Ⅱ抗（1∶10 000）常溫孵育1 h。再次TBST 洗膜后使用ECL 發光液顯色，用ImageJ軟件分析結果。

2.7 動物分組及小鼠頸動脈內皮損傷模型的建立 為觀察PIKfyve 在血管內皮損傷后內膜增生中的作用，將20 只野生型小鼠隨機分為假手術組、頸動脈內皮損傷組、YM201636（PIKfyve 活性抑制劑）組和頸動脈內皮損傷+YM201636 組，每組5 只。小鼠頸動脈內皮損傷模型的建立：按照參考文獻[12]，小鼠稱重后用0.3%的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射以麻醉小鼠，固定在手術臺上；頸部皮膚脫毛并用碘伏消毒，在頸部正中切開1 cm左右小口，分離小鼠左側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，用血管夾暫時夾閉頸總動脈近心端和頸內動脈，結扎頸外動脈遠心端，用0.38 mm 粗糙導絲從頸外動脈近心端插入頸總動脈，來回旋轉通過3 次以損傷血管內皮，迅速取出導絲，結扎頸外動脈穿刺段，松開血管夾恢復血流，縫合小鼠頸部切口。假手術組小鼠與模型組小鼠操作相同但不用導絲損傷頸動脈內皮。術后按分組腹腔注射生理鹽水或YM201636（2 mg·kg-1·d-1），持續15 d。28 d 后，處死小鼠，取出頸總動脈，用4%多聚甲醛固定，以備后續使用。

2.8 HE 染色 取材，固定，石蠟包埋，切片。用二甲苯脫蠟，經各級乙醇及水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化2～10 s，自來水沖洗2 min，伊紅染色30 s～2 min，自來水沖掉多余染液，約10 s，晾干，中性樹膠封片、鏡檢、采圖。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析；兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結果

1 PDGF-BB 增加小鼠VSMC 中PIKfyve 的表達水平

qPCR 和Western blot 結 果 顯 示，與DMSO 組 相比，PDGF-BB 組VSMC 中PIKfyve 的mRNA 表達增加（P＜0.01），蛋白水平亦顯著升高（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. The mRNA and protein levels of PIKfyve were increased in mouse VSMC treated by PDGF-BB. A：the mRNA expression of PIKfyve was detected by qPCR；B：the protein expression of PIKfyve was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs DMSO group.圖1 PDGF-BB 增加 了小 鼠VSMC 中PIKfyve 的mRNA 和蛋白表達水平

2 敲減PIKfyve 抑制PDGF-BB 誘導的小鼠VSMC的增殖和遷移

Ki-67 免疫熒光染色結果顯示，PDGF-BB 處理后VSMC中Ki-67陽性細胞率增加（P＜0.01）；與DMSO+siCon 組相比，無論是否經過PDGF-BB 處理，敲減PIKfyve表達均顯著降低Ki-67 陽性細胞率（P＜0.01）；在敲減PIKfyve的前提下，DMSO 和PDGF-BB處理VSMC 的Ki-67 陽性細胞率無顯著差異，見圖2A。劃痕實驗結果顯示，與DMSO+siCon 組相比，PDGF-BB 使VSMC 劃痕愈合速度增快（P＜0.01），敲減PIKfyve使劃痕愈合速度減慢（P＜0.01）；與PDGFBB+siCon 組相比，PDGF-BB+siPIKfyve 組劃痕愈合速度也顯著減慢（P＜0.01）；在敲減PIKfyve 的前提下，DMSO 和PDGF-BB 處理VSMC 的劃痕愈合速度無顯著差異，見圖2B。

3 PIKfyve 失活抑制PDGF-BB 誘導的小鼠VSMC增殖和遷移

Ki-67 免疫熒光染色結果顯示，與DMSO 組相比，PDGF-BB 增 加Ki-67 陽 性 細 胞率（P＜0.01），YM201636 組Ki-67 陽性細胞率顯著降低（P＜0.01）；與PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+YM201636 組的Ki-67 陽性細胞率也顯著降低（P＜0.01）；YM201636 組與PDGF-BB+YM201636 組的Ki-67 陽性細胞率無顯著差異，見圖3A。劃痕實驗結果顯示，與DMSO 組相比，PDGF-BB 組劃痕愈合速度增快（P＜0.01），YM201636 組 劃 痕 愈 合 速 度 減 慢（P＜0.01）；與PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+YM201636 組劃痕愈合速度也顯著減慢（P＜0.01）；YM201636 組和PDGFBB+YM201636 組劃痕愈合速度無顯著差異，見圖3B。

4 敲減PIKfyve 的表達通過降低mTORC1 活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移

S6（Ser235/236）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化是反映mTORC1 活性的下游靶分子。與DMSO+si-Con 組相比，PDGF-BB 處理使VSMC 的p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平顯著增加（P＜0.05），而敲減PIKfyve使p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與DMSO+siPIKfyve 組相比，在敲減PIKfyve的基礎上再進行PDGF-BB 干預，也不能增加p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋 白 水 平，見 圖4。與PDGF-BB+siPIKfyve 組相比，胰島素的加入增加了p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平，表明胰島素恢復了mTORC1 活性，見圖5A；而在利用胰島素恢復mTORC1 活 性 后，敲 減PIKfyve對PDGF-BB 處 理 后Ki-67 陽性細胞率上升和劃痕愈合速率增快的抑制作用消失，見圖5B、C。

5 PIKfyve 失活通過降低mTORC1 活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移

Western blot 結果顯示，與DMSO 組相比，PDGF-BB 組VSMC 的p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平增加（P＜0.05），YM201636 組p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平降低（P＜0.05）；與PDGF-BB 組相 比，PDGF-BB+YM201636 組 p-S6Ser235/236和 p-4EBP1Thr37/46蛋 白 水 平 也 顯 著 降 低（P＜0.01）；YM201636 組與PDGF-BB+YM201636 組無顯著差異，見圖6A。而在利用胰島素恢復mTORC1 活性后，PIKfyve 失活對PDGF-BB 處理后Ki-67 陽性細胞率上升和劃痕愈合速率增快的抑制作用消失，見圖6B、C。

Figure 2. PIKfyve knockdown suppressed PDGF-BB-induced proliferation and migration of mouse VSMC. A：the proliferation of the cells was detected by Ki-67 staining；B：the migration of the cells was detected by scratch test. Scale bar=50 μm. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs DMSO+siCon group；##P＜0.01 vs PDGF-BB+siCon group.圖2 敲減PIKfyve表達抑制PDGF-BB誘導的小鼠VSMC增殖和遷移

6 抑制PIKfyve 活性能減輕小鼠血管內皮損傷后內膜增生

Western blot 檢測小鼠頸動脈PIKfyve 表達水平，與假手術組相比，頸動脈內皮損傷組PIKfyve 的表達顯著增加（P＜0.01），見圖7A。HE 染色結果顯示，與假手術組相比，頸動脈內皮損傷組內膜增生明顯，內膜/中膜面積比值增高（P＜0.01）；與假手術組相比，假手術+YM201636 組管腔狹窄程度和內膜/中膜面積比值無顯著差異；與頸動脈內皮損傷組相比，頸動脈內皮損傷+YM201636 組頸動脈管腔狹窄程度減輕，內膜/中膜面積比值顯著降低（P＜0.01），見圖7B。

討論

血管經皮介入治療是一種廣泛應用于動脈粥樣硬化相關疾病如冠心病的治療策略，然而，血管再狹窄已成為限制其臨床療效的嚴重并發癥。血管再狹窄的起始步驟是支架等機械性損傷血管內皮[8]，隨后，活化的血小板和炎癥細胞聚集在受損區域并分泌多種細胞因子，如PDGF、白細胞介素6、白細胞介素1β 等[13]。這些生長因子和炎癥介質會促進VSMC從收縮型轉變為增殖型，其特征是增殖、遷移增加，從而導致新生內膜增生和再狹窄[3，14]。VSMC 的增殖和遷移是防治血管再狹窄的一個關鍵環節。本研究使用PDGF-BB 模擬小鼠血管受損后釋放的PDGF的作用，以誘導體外的增殖和遷移，探討PIKfyve 對VSMC增殖和遷移的作用及其機制。

Figure 4. PIKfyve knockdown reduced the activity of mTORC1 in mouse VSMC. The protein levels of p-S6，S6，p-4EBP1 and 4EBP1 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO+siCon group；##P＜0.01 vs PDGF-BB+si-Con group.圖4 敲減PIKfyve表達降低了小鼠VSMC中mTORC1活性

Figure 5. Activation of mTORC1 by insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on proliferation and migration of mouse VSMC exposed to PDGF-BB. A：insulin restored the activity of mTORC1（n=3）；B：activation of mTORC1 by insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on proliferation of VSMC（n=5）；C：insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on migration of VSMC（n=5）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P＜0.05，**P＜0.01 vs PDGFBB+siCon group；##P＜0.01 vs PDGF-BB+siPIKfyve group.圖5 胰島素激活mTORC1逆轉了敲減PIKfyve對PDGF-BB誘導的小鼠VSMC增殖和遷移的抑制作用

PIKfyve 是一種相對保守的脂質激酶，其主要生理功能為糖代謝調控、抑制肥胖、內體運輸和調節自噬等[15-17]。既往研究顯示PIKfyve 在心臟、脂肪、血管和骨骼肌等組織中豐富表達[17]。Tronchere 等[6]的研究結果表明，PIKfyve 的抑制通過sirtuin-3 依賴性途徑減輕心肌細胞線粒體活性氧產生并減少細胞凋亡，在高脂致肥胖小鼠模型中，PIKfyve 的抑制減輕心肌肥大并改善心臟功能。Cao 等[7]使用螢光素酶實驗鑒定PIKfyve為微小RNA（microRNA，miR）-32-5p的靶基因，并認為PIKfyve 通過抑制BV2細胞中腫瘤壞死因子α 的產生進而減輕血管的鈣化。上述研究表明PIKfyve 在心臟和血管中發揮重要作用，但PIKfyve 在機械性損傷后血管內膜增生中的作用及機制尚未明確。研究表明，抑制PIKfyve 可以降低多種細胞如肝癌細胞、淋巴瘤細胞、成纖維細胞等的增殖和遷移[9-11]，但其在VSMC 增殖和遷移中是否發揮調控作用并不清楚。本研究顯示PIKfyve 在PDGFBB 處理后的VSMC 中表達增加，而降低PIKfyve 活性或敲減PIKfyve表達，均可以抑制PDGF-BB 誘導的VSMC 增殖和遷移。這說明PIKfyve 表達上調可以促進VSMC 的增殖和遷移過程，但是其調控VSMC 增殖和遷移的機制目前暫不清楚。

Figure 6. PIKfyve inactivation inhibited the proliferation and migration of mouse VSMC via reducing mTORC1 activity. A：PIKfyve inactivation reduced the activity of mTORC1 in VSMC（n=3）；B：activation of mTORC1 by insulin reversed the effect of PIKfyve inactivation on proliferation of VSMC（n=5）；C：insulin reversed the effect of PIKfyve inactivation on migration of VSMC（n=5）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P＜0.05 vs DMSO group；##P＜0.01 vs PDGF-BB group；△△P＜0.01 vs PDGFBB+YM201636 group.圖6 PIKfyve失活通過降低mTORC1活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移

Figure 7. Inhibition of PIKfyve activity decreased neointimal hyperplasia after mouse vascular endothelial injury. A：the protein expression of PIKfyve was determined by Western blot（n=3）；B：the vascular intima/media ratio was measured by HE staining（n=5）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. **P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs sham+saline group；△△P＜0.01 vs injured+saline group.圖7 抑制PIKfyve活性能減輕小鼠血管內皮損傷后內膜增生

mTORC1 是一種蛋白激酶復合物，在控制細胞生長、增殖、遷移、新陳代謝等生物學過程中發揮關鍵作用[18]。結節性硬化復合物（tuberous sclerosis complex，TSC）1/2 異二聚體是mTORC1 上游的關鍵負性調控因子，它作為GTP 酶的激活蛋白，可使下游的腦Ras 同源蛋白（Ras homolog enriched in brain，Rheb）處于與GTP 解離的失活狀態，從而抑制mTORC1[19]。Sun等[12]的研究表明，PDGF-BB促進了mTORC1 的活化，利用VSMC 特異性的TSC1基因敲除激活mTORC1 后，促進了VSMC 異常增殖、遷移及血管內皮機械性損傷后的內膜增生。但PIKfyve 是否通過影響mTORC1參與VSMC增殖、遷移調控并不清楚。因此，我們進一步在VSMC 中研究了PIKfyve對mTORC1 活性的影響。S6（Ser235/236）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化是反映mTORC1 活性的兩個下游核心指標[18]。我們的體外實驗表明，敲減PIKfyve表達或者抑制PIKfyve 活性均能降低S6 和4EBP1 的磷酸化水平。既往研究也支持PIKfyve 正向調控mTORC1 活性，在3T3-L1 脂肪細胞中，敲減PIKfyve表達降低了p-S6 和p-4EBP1 水平[20]。既往研究表明，胰島素通過PI3K/Akt 通路激活mTORC1 的活性[19]。在本研究中胰島素的干預逆轉了敲減PIKfyve表達后降低的S6 和4EBP1 的磷酸化水平，表明胰島素激活了mTORC1 活性，而利用胰島素恢復mTORC1 活性后，敲減PIKfyve表達或者抑制PIKfyve活性對VSMC 增殖和遷移的抑制作用消失。據此推論，PIKfyve 可能通過誘導mTORC1 活化來促進VSMC的增殖和遷移。

為了進一步研究PIKfyve 在血管內膜增生中發揮的作用，本研究采用機械性損傷血管內皮法構建了小鼠頸總動脈內皮損傷模型。結果顯示，PIKfyve在頸總動脈內皮損傷后表達增加，提示PIKfyve 可能在內膜增生中發揮促進作用。PIKfyve 活性抑制劑的使用可以減輕血管損傷后的內膜增生和管腔狹窄程度，說明PIKfyve 誘導小鼠血管損傷后內膜增生。但是PIKfyve 在血管再狹窄中的作用機制仍有較多未知。本項工作主要集中于體外實驗研究，在體內的機制研究仍需進一步探討。

綜上所述，PIKfyve 可通過誘導mTORC1 活化來促進小鼠VSMC 的增殖和遷移，表明抑制PIKfyve 表達或活性可能是防治血管再狹窄的新靶點。本研究為血管再狹窄的防治提供了參考資料。