雷公藤甲素調節NF-κB通路對膿毒血癥大鼠心肌損傷的保護作用*

孫貝貝， 陳雪梅， 王爍陽， 楊 倩， 楊永芝， 朱 紅， 陳雪祎， 王海華△

（1皖南醫學院生理教研室，2皖南醫學院臨床醫學院，3皖南醫學院口腔醫學院，安徽蕪湖241002）

膿毒血癥是宿主對感染或損傷的全身有害反應，嚴重者會造成休克。大量研究表明，心肌功能障礙是膿毒血癥患者的常見并發癥。然而，膿毒血癥引起的心肌功能障礙的確切機制尚不明確[1]。相關研究顯示，心肌的炎癥以及炎癥信號的持續激活是膿毒血癥心功能障礙的起始環節[2]。諸多研究顯示，Toll 樣受體信號通路的下游信號分子NF-κB 在免疫應答和炎癥的各個階段的早期生物進程扮演了重要角色，尤其與心肌炎性損傷密切相關[3]。由于膿毒血癥心肌損傷病死率高，同時沒有安全有效的藥物，因此探討膿毒血癥心肌損傷發病機制和尋求有效防治藥物至關重要。

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從藥用植物雷公藤中分離出來的主要活性天然產物，這些化合物表現出相似的藥理活性，在腫瘤和炎癥的發展中起著至關重要的作用[4]。近期研究表明，TP通過下調NFκB 信號通路減輕膜性腎小球腎炎大鼠的炎癥反應[5]，TP 通過抑制NF-κB 的活性和表達來減輕小鼠急性肺損傷[6]，TP 通過NF-κB 通路抑制小膠質細胞活化改善脊髓損傷[7]，但其在膿毒血癥心肌損傷中的作用機制和作用靶點尚不明晰。本文應用CLP 法構建膿毒血癥模型，進一步探討雷公藤甲素在膿毒血癥心肌損傷中的器官保護機制，為膿毒血癥心肌損傷提供參考資料。

材料和方法

1 動物

60 只SPF 級3 月齡雄性SD 大鼠（290±20）g 許可證號SCXK（魯）20140007，適應性喂養一周。

2 藥物試劑與儀器

TP（T819207-20 mg，純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；cTn-I 酶聯免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所）；CK-MB、IL-6 和TNF-α 酶聯免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；兔抗鼠GAPDH 單克隆抗體，兔抗鼠TLR4 單克隆抗體和兔抗鼠NF-κB p65 單克隆抗體（武漢三鷹有限公司）；兔抗TAK1（抗體CST）；ECL 化學發光液（上海生物工程有限公司）；PowerLab8-35Power Lab 系統（埃德儀器公司）；電泳儀和轉膜槽（Biorad）；超靈敏多功能成像儀AI600和高速離心機（GE）

3 實驗方法

3.1 膿毒血癥模型的建立 SD 大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射，麻醉后固定于鼠板，先去除腹部毛發，沿腹白線做1 cm 的中線切口，逐層打開腹腔，并找到盲腸。然后在盲腸末端1 cm處用3/0絲線緊密地結扎，并使用7 號針在距其遠端約0.5 cm 處穿刺兩次。擠出少量糞便放入腹腔。將盲腸放回其正常的腹腔內位置，并以兩層閉合腹部。在沒有CLP 的情況下，假手術（sham）組中的大鼠進行完全相同的程序。所有動物在手術后立即皮下注射30 mL/kg 生理鹽水進行液體復蘇并給予大鼠復溫。48 h后大鼠出現精神萎靡、活動減少、食欲減退，解剖大鼠發現腸腔有水腫、黏連、血性液體，即造模成功[8-10]。

3.2 分組和給藥 將60只大鼠隨機分配為6組（n=10）：假手術（sham）組、CLP 組、CLP+TP-L（50 μg/kg）、CLP+TP-M（100 μg/kg）、CLP+TP-H（200 μg/kg）和CLP+PMX-B（1 mg/kg）組[11-14]。所有大鼠術前禁食，不限制飲水。采用CLP 法建立膿毒血癥心肌損傷模型。TP各干預組和CLP+PMX-B組術后4 h腹腔注射藥物，24 h 后再注射一次。48 h 后，麻醉處死大鼠，測試相應指標。

3.3 大鼠生存分析 構建膿毒血癥模型后，每12 h觀察大鼠的存活情況，連續觀察72 h，統計生存率并進行比較。

3.4 血流動力學參數測定 大鼠麻醉后由右頸總動脈插管，通過PowerLab 系統先測定平均動脈壓（mean arterial blood pressure，MABP），再測左心室收縮峰壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、心率（heart rate，HR）、左心室內壓最大上升/下降速率（maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax）。

3.5 HE 染色 采血后立即取大鼠的心臟，然后放入40%多聚甲醛溶液中固定。將組織脫水和石蠟包埋，然后進行病理切片。HE 染色后，切片在55℃烘箱中烘20 min后封片，并在光學顯微鏡下觀察。

3.6 大鼠血清中CK-MB 和cTn-I 含量和血漿中TNF-α和IL-6的含量測定 CLP術后48 h采血，取兩份血液分別放入肝素抗凝管和普通EP 管中，靜置離心后分血漿和血清備用。通過相應的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，測定平均吸光度（A）值。

3.7 Western blot 法檢測TLR4、TAK1 和NF-κB p65的表達情況 稱取0.05 g 心肌組織提總蛋白，每個樣品取200 uL 上清液，加入5× SDS-PAGE 上樣緩沖液50 μL，在沸水中變性5 min，行8% SDS-PAGE 后，電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜，然后用脫脂奶粉封閉2 h 后，放入Ⅰ抗（1∶1 000）中過夜孵育，然后在Tris 緩沖鹽水吐溫中洗滌3 次，加入Ⅱ抗（1∶5 000），并孵育1 h。電化學發光（ECL）用于顯影圖像。通過ImageJ 軟件分析靶蛋白條帶的灰度值。實驗進行了3次。

4 統計學處理

所有數據均由SPSS 17.0 統計軟件處理。測量數據以平均值±標準差（mean±SD）的形式表示。數據符合正態分布時使用單因素方差分析進行多組之間的比較。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

結果

1 各組大鼠72 h生存率分析

結果顯示：sham組大鼠72 h內均沒有出現死亡，與sham 組相比，CLP組存活率下降（P＜0.05），與CLP組相比，CLP+TP-M、CLP+TP-H 組和CLP+PMX-B 組均能提高大鼠生存率（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Comparison of rat survival rate in each group.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CLP group.圖1 各組大鼠生存率的比較

2 各組大鼠MAP和心功能變化

心功能指標檢測結果顯示，與sham 組相比，CLP 組大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax顯著降低（P＜0.05）；與CLP 組相比，CLP+TP-M 組、CLP+TP-H組和CLP+PMX-B 組大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax均顯著升高（P＜0.05），見圖2及表1。

3 各組大鼠血清中CK-MB和cTn-I含量

CLP 組CK-MB 和cTn-I 含 量 高 于sham 組（P＜0.05）；TP各干預組和CLP+PMX-B組CK-MB和cTn-I 含量均低于CLP 組（P＜0.05）；與CLP+TP-L 組比較，CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 組中CKMB和cTn-I含量顯著降低（P＜0.05），見表2。

4 各組大鼠血漿中TNF-α和IL-6含量

CLP 組TNF-α 和IL-6 含 量 高 于sham 組（P＜0.05）；TP 各干預組和CLP+PMX-B 組TNF-α 和IL-6含量均低于CLP 組（P＜0.05）；與CLP+TP-L 組比較，CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 組中TNF-α 和IL-6含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

5 各組心肌組織病理變化

HE 染色結果顯示，sham 組心肌細胞完整，肌纖維清晰排列，無炎癥細胞浸潤；CLP組可見血管擴張充血，心肌細胞灶狀變性壞死，炎癥細胞浸潤；與CLP 組相比，CLP+TP-L 組未見明顯炎癥細胞浸潤，但心肌細胞腫脹，橫紋消失，細胞核固縮；而CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 組心肌細胞病理改變好轉趨于正常，見圖3。

6 各組大鼠心肌組織中TLR4、TAK1 和NF-κBp65蛋白的表達

Figure 2. Changes in cardiac function of rats in each group.圖2 各組大鼠心功能變化

表1 各組大鼠心功能變化Table 1. Changes of cardiac function in rats in each group（Mean±SD. n=10）

表2 各組大鼠血清中CK-MB和cTn-I含量比較Table 2. Comparison of CK-MB and cTn-I levels in serum of rats in each group（Mean±SD. n=10）

表3 各組大鼠血漿中TNF-α和IL-6含量比較Table 3. Comparison of TNF-α and IL-6 levels in plasma of rats in each group（Mean±SD. n=10）

Figure 3. Pathological results of myocardium with HE staining. A and D：the cardiomyocytes in sham group were intact；B and E：in CLP group，vascular dilatation and congestion，focal degeneration and necrosis of cardiomyocytes，and inflammatory cell infiltration were observed；C and F：in CLP+TP-L group，the myocardial cells were swollen；G-L：transverse striae disappeared and nuclei were shrunken. The pathological changes of myocardial cells in CLP+TP-M，CLP+TP-H and CLP+PMXB groups were improved and tended to be normal. Scale bar=100 μm in A，B，C，G，H and I；scale bar=20 μm in D，E，F，J，K and L.圖3 HE染色心肌病理結果

Western blot 結果顯示，CLP 組TLR4、TAK1 和NF-κB p65 蛋白表達量顯著高于sham 組（P＜0.05）；CLP+TP-M、CLP+TP-H和CLP+PMX-B組TLR4、TAK1和NF-κB p65 蛋白表達量均低于CLP 組（P＜0.05）；而CLP+TP-L 組TLR4 和NF-κB p65 蛋白表達量與CLP組相比無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 4. Expression levels of TLR4，TAK1 and NF-κB p65 proteins in myocardium of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CLP group；△P＜0.05 vs CLP+TP-L group.圖4 TLR4、TAK1和NF-κB p65蛋白在各組大鼠心肌中的表達水平

討論

臨床上耐藥菌株的日漸增多與抗菌藥物的濫用有關，導致了膿毒血癥患者的抗生素療效不盡人意，新型抗菌藥物的研發及其臨床應用滯后，致使膿毒血癥患者死亡的發生率居高不下[15]。通過盲腸結扎穿刺法復制大鼠膿毒血癥更接近臨床患者病理進程，是研究其發生發展機制的合適模型[16]。多器官功能障礙和衰竭是臨床上膿毒血癥患者常見的并發癥，心臟是膿毒血癥造成的常見受損靶器官[17]。心肌的炎癥以及炎癥信號的持續激活是膿毒血癥心功能障礙的起始環節[2]。深入探究膿毒血癥的發病機制并尋求有效的防治藥物對于防治膿毒血癥尤為重要。

本實驗復制的膿毒血癥大鼠體內致病菌革蘭氏陰性菌最常見，細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌外膜的主要成分，當LPS 進入大鼠體內與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）受體結合，活化NF-κB 信號通路，NF-κB 主要以p65-p50 二聚體的形式存在，p65 亞基與多種炎癥性疾病有關[18-19]。炎癥疾病中，由巨噬細胞產生的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）在膿毒血癥導致的心肌炎性損傷中扮演重要角色[20]。多黏菌素B 常用于治療臨床難治性革蘭陰性菌感染患者[21]。

TP具有抗炎、免疫調節等藥理作用，我們研究室前期實驗證實TP 能改善內毒血癥大鼠血管低反應性，可能是通過TLR4/NF-κB 通路保護內皮功能實現的[14]。TLR4/NF-κB 通路是經典的炎癥信號通路，不僅刺激細胞因子的表達，而且致使炎癥反應級聯放大，TAK1 通過激活的JNK 和p38 MAPK 發起MKK 級聯，刺激IκB激酶，導致NF-κB活化，在此信號轉導級聯效應中起著關鍵調節作用[22-23]。

cTn-I存在于心肌細胞中，血清中cTn-I水平與心肌功能損傷程度呈正相關，CK-MB 是診斷心肌損傷特異性較高度的酶[24]。MABP 反映血管張力變化，HR×LVDP 代表心臟做功，+dp/dtmax和-dp/dtmax絕對值大小，反映大鼠心臟收縮和舒張功能強弱[25]。

作為臨床上常用的有效的抗炎藥雷公藤甲素，對于其作用機制研究是當今研究的熱點，有關其通過抗炎作用在膿毒血癥心肌損傷中的作用及其作用機制研究尚鮮有文獻報道[26]。實驗結果表明，與sham 組相比，CLP 組大鼠生存率低，心功能顯著下降，心肌血管擴張充血、炎癥細胞浸潤、細胞灶狀變性壞死；血清中CK-MB、cTn-I及血漿中TNF-α和IL-6的含量顯著增高，心肌TLR4、TAK1 和NF-κB p65 的蛋白表達顯著增多；與CLP 組相比，TP 干預后，呈劑量依賴性提高膿毒血癥大鼠生存率，改善其心肌結構和功能，使血清中CK-MB 和cTn-I及血漿中TNF-α和IL-6 的含量顯著降低，心肌TLR4、TAK1 和NF-κB p65 的蛋白表達亦顯著減少。實驗結果證實，TP 干預后對膿毒血癥大鼠心肌損傷有明顯的保護作用。

綜上所述，通過TP 干預后，TP 能降低CLP 大鼠體內TNF-α 和IL-6 的釋放，使 其 血 液 中CK-MB 和cTn-I 的含量減少，從而對CLP 大鼠心肌損傷起到明顯的保護作用，其效應可能與抑制TLR4/TAK1/NFκB信號通路有關。