蝦青素通過抑制活性氧簇/NLRP3炎癥小體減輕對比劑引起的大鼠急性腎損傷*

宋 亮， 姚 舜， 孫延虎， 吳 鑫， 李文華，2△

（徐州醫科大學 1心血管病研究所，2附屬醫院心血管內科，江蘇徐州221000）

隨著近年來冠心病介入診療技術的發展，對比劑的使用日益增多。對比劑急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）已經成為醫源性腎功能損傷的第3 位原因[1]。CI-AKI 的發病機制尚未完全明確，目前主要認為與對比劑對腎小管上皮細胞的直接腎毒性、腎臟血流動力學改變和氧化應激損傷等有關[2]。CI-AKI 尚無有效的治療方法，水化療法已經被證實可以有效預防CI-AKI[3]。多種藥物如N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）、他汀[4-5]等也被研究應用于CI-AKI 的防治。NAC 作為一種公認的抗氧化劑，可以抑制組織活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的生成，減輕大鼠對比劑急性腎損傷已經得到實驗證實[6]，但尚無循證醫學證據證明其在臨床CI-AKI的預防中有著積極作用。蝦青素（astaxanthin，AST）是一種天然存在的紅色類胡蘿卜素，是一種強效的抗氧化劑，目前有研究表明蝦青素通過減輕氧化應激，抑制細胞凋亡[7]，減輕CIAKI，但其具體機制仍未明確。本實驗通過大鼠CIAKI 模型，研究核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）在CI-AKI 發生中的作用及蝦青素干預效果，為研究預防CI-AKI 藥物提供實驗依據。

材料和方法

1 實驗動物與試劑

SPF級SD雄性大鼠40只，重（180±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司（動物合格證號為1107261911002306）。

2 主要試劑

蝦青素、NAC 和N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME）購自北京索萊寶；碘海醇（每mL 含350 mg I）購自揚子江藥業；吲哚美辛（上海麥克林）；4%多聚甲醛（武漢賽維爾）；血清肌酐（serum creatinine，SCr）試劑盒和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（南京建成）；RIPA（強）、PMSF、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒和5×蛋白上樣緩沖液（上海碧云天）；SDS-PAGE 變性丙烯酰胺凝膠試劑盒（上海生工生物工程）；Protein Ladder（10～180 kD）購自Thermo Fisher Scientific；PVDF膜（Millipore）；BSA（Vicmed）；TUNEL 試 劑 盒（Roche）；兔抗NLRP3 抗體（Abcam）；兔抗含胱天蛋白酶募集結構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）抗體和兔抗白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（Bioss）；兔抗胱天蛋白酶1（caspase-1）抗體、兔抗IL-18 抗體、鼠抗GAPDH抗體、山羊抗兔IgG 抗體和山羊抗鼠IgG 抗體（Proteintech）；ECL 顯色液（Bioworld）。實驗中蝦青素溶解于橄欖油配制成1 g/L 溶液；NAC 和L-NAME 溶解于PBS配制成10 g/L溶液；吲哚美辛溶解于PBS配制成1 g/L溶液。

3 主要方法

3.1 動物分組與造模方法 40 只大鼠隨機分為5組，對照組（control組）、蝦青素對照組（AST組）、造模（contrast media，CM）組、蝦青素預處理治療組（AST+CM 組）及NAC 預處理治療組（NAC+CM 組），每組各8 只。大鼠CI-AKI 模型的建立參考前人文獻中的方法[8]，具體操作如下：所有大鼠禁食禁水12 h 后經10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉，除control 組及AST組大鼠外，其他組大鼠經尾靜脈依次緩慢注射吲哚美辛（10 mg/kg）、L-NAME（10 mg/kg）和碘海醇（3 g I/kg），注射兩種藥物中間間隔15 min。對照組及蝦青素對照組大鼠則于相同時間點分別依次注射等量PBS、生理鹽水和生理鹽水。其中AST 組和AST+CM組大鼠于造模前7 d 和造模后3 d 以10 mg/kg 的AST溶液灌胃，其他組大鼠以等體積橄欖油灌胃；NAC+CM 組大鼠造模前12 h 進行10 mg/kg NAC 溶液腹腔注射。所有組大鼠于灌胃第8 天進行CI-AKI 模型的建立，72 h 后心臟穿刺取血6～8 mL，室溫靜置1 h 后4℃、3 000 r/min 離心15 min，取上清置于-80℃冰箱待用。剪開腹部皮膚及肌肉組織，分離出雙側腎臟，取一部分固定于4%多聚甲醛溶液，4℃冰箱保存，用于石蠟切片的制作及HE 染色，TUNEL，及免疫組化檢測。另一部分固定于-80℃冰箱，用于提取組織蛋白及冰凍切片ROS染色。

3.2 血清生化指標的檢測 取保存的血清樣本，按試劑說明書檢測SCr水平和BUN水平。

3.3 HE 染色 取固定于4%多聚甲醛中的腎臟組織，按脫水透明浸蠟、包埋、切片步驟制作石蠟切片，按脫蠟、蘇木素-伊紅染色、脫水步驟進行切片HE 染色，光學顯微鏡（×400）觀察分析。

3.4 TUNEL實驗 取用制作好的石蠟切片，按照組織修復、滴加TUNEL 工作液、DAB 染色、細胞核復染等步驟進行TUNEL 染色，光學顯微鏡（×400）觀察，用ImageJ軟件統計分析腎小管上皮細胞凋亡率。

3.5 ROS 染色 取凍存于-80℃的腎臟組織制作腎臟冰凍切片，依照淬滅熒光、滴加ROS 染液、DAPI 復染進行腎組織冰凍切片ROS 染色，熒光顯微鏡（×400）觀察分析。

3.6 免疫組織化學染色 取用制作好的石蠟切片，將其進行抗原修復、封閉等步驟后，按照說明書要求比例配制NLRP3（1∶100）、ASC（1∶100）、IL-1β（1∶100）和IL-18（1∶50）Ⅰ抗工作液孵育過夜后滴加相應Ⅱ抗工作液，隨后進行DAB顯色和細胞核復染，光學顯微鏡（×400）觀察分析，ImageJ 軟件統計分析陽性率。

3.7 Western blot 檢測蛋白含量 用RIPA、PMSF 提取組織蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，將制好的蛋白樣本置入電泳儀電泳，電泳完成后應用PVDF 膜電轉，電轉結束后脫脂奶粉封閉，按說明書配制抗NLRP3（1∶500）、ASC（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和IL-18（1∶1 000）抗體工作液，4℃搖床孵育10 h，相應Ⅱ抗（1∶5 000）孵育1 h，ECL 化學發光成像系統檢測成像。以GAPDH 為內參照，采用ImageJ 1.40軟件進行分析，測其積分吸光度，計算上述蛋白的相對表達量。

4 統計學處理

用GraphPad Prism 8.0 軟件對實驗數據進行統計學分析。計量數據以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間數據的比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），各組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 大鼠腎功能指標檢測

大鼠血清肌酐和血尿素氮檢測結果如表1 所示。與control組相比，AST組大鼠SCr和BUN水平無明顯變化，差異無統計學顯著性（P＞0.05）；CM 組大鼠的SCr和BUN水平均明顯增高（P＜0.01）；與CM組相比，給予AST 或NAC 預處理均可以顯著下降SCr和BUN的水平（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠SCr和BUN水平及腎小管上皮細胞凋亡率的檢測結果Table 1. The levels of SCr and BUN，and apoptotic rate of renal tubular epithelial cells of the rats in each group（Mean±SD. n=5）

2 腎臟HE染色

腎臟HE 染色結果如圖1 所示，control 組及AST組大鼠的腎臟腎小球結構正常，小管上皮完整，無腫脹變性；CM 組大鼠可見腎小管腫脹充血，管腔阻塞，小管上皮細胞空泡樣變性，可見少量壞死細胞；AST+CM組和NAC+CM組大鼠的腎臟損傷較CM組明顯減輕，可見少量上皮細胞空泡變性及管腔充血。

3 TUNEL檢測腎小管上皮細胞凋亡

TUNEL 陽性細胞細胞核被染為棕褐色，結果如圖2、表1 所示。與control 組相比，AST 組大鼠腎小管上皮細胞凋亡水平無明顯變化，差異無統計學顯著性（P＞0.05）；CM 組大鼠腎小管上皮細胞凋亡水平明顯增高（P＜0.01）；與CM 組相比，AST+CM 組和NAC+CM組的細胞凋亡水平明顯降低（P＜0.01）。

4 冰凍切片ROS染色

ROS陽性細胞在510～560 nm激發波長下呈紅色熒光，正常細胞在330～380 nm 激發波長下成藍色熒光。ROS 染色結果顯示，與control 組和AST 組相比，CM組ROS陽性表達細胞明顯增多；與CM組相比，應用AST 和ROS 抑制劑NAC 預處理均可以減少腎小管上皮細胞ROS的生成，見圖3。

5 免疫組化染色觀察

5.1 NLRP3 炎癥小體組分NLRP3 和ASC NLRP3免疫組化結果顯示，各組大鼠腎臟組織內均有一定量NLRP3 的表達。與control 組相比，AST 組大鼠NLRP3 表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），CM 組大鼠NLRP3 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與CM 組相比，AST+CM 組和NAC+CM 組大鼠NLRP3表達顯著減少（P＜0.01），見圖4。ASC免疫組化結果顯示，各組大鼠腎臟組織內均有一定量ASC 的表達。與control 組相比，AST 組大鼠ASC 表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），CM 組大鼠ASC 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與CM 組相比，AST+CM 組和NAC+CM 組 大 鼠ASC 表 達 顯 著 減 少（P＜0.01），見圖5。

Figure 1. Histopathological observation（HE staining，×400，scale bar=50 μm）. Proximal and distal tubules were normal，and no vacuolization in control group was observed. Renal tubular epithelial cells were arranged loosely and disorderly，significant vacuolization，proteinaceous cast and tubular necrosis in CM group were found. These microscopic changes had attenuated in AST and NAC groups.圖1 各組大鼠腎臟HE染色

Figure 2. TUNEL staining of rat kidneys in each group showed apoptosis（×400，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖2 各組大鼠腎臟TUNEL染色

Figure 3. ROS staining of rat kidneys in each group showed oxidative stress（×400，scale bar=50 μm）.圖3 各組大鼠腎臟冰凍切片ROS染色

Figure 4. Immunohistochemistry results of NLRP3 in each group（×400，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖4 各組大鼠NLRP3免疫組化表達情況

5.2 IL-1β IL-1β 的免疫組化結果顯示，各組大鼠腎臟組織內均有IL-1β 表達，control 組和AST 組的IL-1β 表達水平較低；與control 組相比，AST 組大鼠IL-1β 表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），CM 組大鼠的IL-1β 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與CM 組相比，AST+CM 組的IL-1β 表達水平降低（P＜0.05），NAC+CM 組 的IL-1β 表 達 水 平 降 低（P＜0.01），見圖6。

5.3 IL-18 IL-18 的免疫組化結果顯示，CM 組、AST+CM 組和NAC+CM 組的大鼠腎臟組織內均有一定量IL-18 的表達，而control 組和AST 組的IL-18 表達水平較低。與control 組相比，AST 組大鼠IL-18 表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），CM 組大鼠的IL-18 表達水平顯著增高（P＜0.01）；與CM 組相比，應用AST和NAC預處理均可顯著降低IL-18的表達水平（P＜0.01），見圖7。

6 Western blot檢測結果

6.1 NLRP3 炎癥小體組分NLRP3、ASC 和caspase-1 p20的表達 如圖8所示，與control組相比，AST組大鼠的NLRP3 炎癥小體各組分NLRP3、ASC 和caspase-1 p20 的表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），CM 組大鼠NLRP3、ASC 和caspase-1 p20的表達水平均顯著增高（P＜0.01）；與CM 組相比，AST+CM 組和NAC+CM 組大鼠NLRP3 炎癥小體各組分的表達明顯減少（P＜0.01）。

Figure 5. Immunohistochemistry results of ASC in each group（×400，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖5 各組大鼠ASC免疫組化表達情況

Figure 6. Immunohistochemistry results of IL-1β in each group（×400，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖6 各組大鼠IL-1β免疫組化表達情況

6.2 IL-1β 和IL-18 的表達 如圖9 所示，與control組相比，AST 組大鼠的IL-1β 和IL-18 表達水平的差異無統計學顯著性（P＞0.05），CM 組大鼠的IL-1β 和IL-18表達水平均顯著增高（P＜0.01）；與CM 組相比，應用AST或NAC預處理可顯著降低IL-1β和IL-18的表達（P＜0.01）。

討論

CI-AKI 是指應用對比劑后48～72 h 內，SCr 水平升高0.5 mg/dL（44 μmol/L）或較基線升高≥25%，并除外其他腎損傷的可能[9]。CI-AKI 的發生與患者本身和患者接受對比劑的方式都有關。CI-AKI在一般患者中發生率并不高，而慢性腎臟疾病是CI-AKI 最強的危險因素，且患者的基礎腎功能越差，發生CIAKI 的風險越高[10]。目前尚無有效治療CI-AKI 的方法，因此預防受到了臨床的廣泛關注。目前公認水化療法是有效的預防措施，但心、腎功能不全患者無法充分水化[11]?，F認為CI-AKI發生的病理生理機制主要包括：（1）碘對比劑對腎小管上皮細胞的直接毒性作用，導致細胞功能喪失、細胞壞死和凋亡[12]；（2）腎臟血流動力學改變[2]；（3）腎髓質對缺氧的高敏感性[13]；（4）氧化應激損傷[14]。有實驗研究表明，NAC 可以減輕在缺血再灌注引起的氧化應激，其可能改變腎臟血流動力學，直接減弱其氧化應激反應而起到預防CI-AKI的作用[15]。

Figure 7. Immunohistochemistry results of IL-18 in each group（×400，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖7 各組大鼠IL-18免疫組化表達情況

Figure 8. The protein expression of NLRP3，ASC and caspase-1 p20 in the rats of each group. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖8 各組大鼠NLRP3、ASC和caspase-1 p20蛋白的表達

NLRP3 是NLR 家 族 的 一員，能 夠通 過ASC 與caspase-1組成多蛋白復合體，即NLRP3炎癥小體[16]。正常情況下，NLRP3 炎癥小體的活化可觸發防御性炎癥反應，清除病原體。但持續或異常的NLRP3 活化是許多慢性病或退行性疾病的基礎。已有多項研究證實，NLRP3 炎癥小體的不恰當活化與糖尿病、痛風、動脈粥樣硬化、骨關節炎、阿爾茨海默病的發生有關[17-21]。最近的研究表明，NLRP3 炎癥小體及其介導的下游細胞凋亡和炎癥反應，在CI-AKI 的發生發展中起著重要作用[22-24]。目前NLRP3 炎癥小體活化的機制尚未完全闡明。NLRP3炎癥小體活化的可能機制包括：（1）K+外流[25]；（2）細胞溶酶體的吞噬作用[26]；（3）ROS 的生成[27]；（4）Ca2+內流[28]。目前ROS 被認為是激活NLRP3 炎癥復合物的關鍵分子之一，ROS 可以通過特有途徑誘導NLRP3 炎癥小體的組裝和激活[29]。

Figure 9. The protein expression of IL-1β and IL-18 in the rats of each group. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs CM group.圖9 各組大鼠IL-1β和IL-18蛋白的表達

蝦青素作為自然界最強的抗氧化劑，其抗氧化性是維生素E 的數百倍，有報道指出蝦青素可以抑制氧化應激誘導的線粒體功能障礙和ROS 的產生，對抗炎、抗凋亡具有積極的作用[30]。有研究表明蝦青素可以保護高糖暴露下的近端腎小管上皮細胞[31]，改善糖尿病腎病大鼠的炎癥反應和凋亡[32]。我們在實驗中發現蝦青素作為抗氧化劑，與ROS 抑制劑NAC 都可以抑制腎組織ROS 的產生。與此同時，我們發現CI-AKI 大鼠腎臟中NLRP3 炎性體組分和下游炎癥介質IL-1β 和IL-18 的表達均明顯增高，而蝦青素可以拮抗此效應。因此我們推測，蝦青素可以通過抑制ROS 的產生，抑制NLRP3 炎癥小體的活化，抑制下游炎癥反應和凋亡，從而減輕大鼠CIAKI。雖然本實驗證實蝦青素可以減輕大鼠CI-AKI，為CI-AKI 的預防提供了新的思路，但蝦青素對腎臟的保護作用機制和臨床應用仍需要進一步研究。