白及非多糖組分止血活性成分研究

趙菲菲，李 靖，徐國波,，王永林，席曉嵐，廖尚高,*

1貴州醫科大學藥學院，貴陽 550004；2貴陽市第一人民醫院藥劑科，貴陽 550001；3貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴陽 550004

白及為蘭科植物白及(Bletillastriata(Thunb.) Reichb.F.)的干燥塊莖，又名甘根、白根、地螺絲等，是《中國藥典》收載的常用中藥之一，具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌之功效，臨床上主要用于咯血、吐血、外傷出血等治療[1,2]。化學研究表明白及藥材中除含有大量多糖類物質外，還含有較多的非多糖類物質，如芪類、聯芐類、菲類、聯菲類等近五十種化學成分[3-8]。近年來，我國科研人員對白及藥材的藥理研究主要集中在白及的多糖部分，但隨著白及藥材中化學成分研究的不斷深入，白及非多糖部分也成為藥理活性研究熱點。本課題組在前期研究中已證實BS-80EE[9-12]具有良好的止血藥效，它可顯著縮短肝素化的小鼠出血時間和凝血時間(CT)；可刺激大鼠血小板的活化，使血小板聚集作用增強；可作用于凝血纖溶系統，加速血液的凝固，抑制纖維蛋白降解，同時使血液黏度增加，血流速度變慢而發揮止血作用。但BS-80EE發揮止血的藥效物質基礎尚不明確，因此本研究采用超高壓液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)對BS-80EE中的化學成分進行分析，明確其主要化學成分，并采用ADP、THR誘導的血小板聚集實驗和小鼠CT實驗對已確認的化學成分進行止血活性評價，以期初步闡明BS-80EE發揮止血的活性物質。

1 材料與試劑

1.1 動物

SPF級KM小鼠(雌雄各半)，體質量20～22 g；SPF級SD大鼠(雌雄各半)，體質量200～240 g；均由貴州醫科大學實驗動物飼養中心提供，許可證號：SCXK(黔)2012～0001。實驗動物在室溫22～24 ℃，相對濕度為60%條件下自由攝食飲水，實驗前適應性飼養7天。

1.2 藥品與試劑

白及非多糖組分(BS-80EE)(實驗室自制[9])；硫酸魚精蛋白注射液(批號09150303，北京悅康凱悅制藥有限公司)；酚磺乙胺注射液(批號20160715，國藥集團容生制藥有限公司)；水合氯醛(批號20151220，國藥集團化學試劑有限公司)；ADP(批號91M7002V，Sigma公司)；凝血酶(THR，批號20160921，北京索萊寶科技有限公司)；甲醇(色譜純，德國Merck 公司)；乙腈(色譜純，德國Merck 公司)；甲酸(美國TEDIA有限公司，色譜純)；純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；對照品4-hydroxymethylphenylβ-D-glucoside、α-isobutylmalic acid、blestroside、dactylorhin A、gymnosides I、militarine、4,7-dihydroxy-2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene、gymnosides V、gymnosides Ⅸ、4,7-dihydroxy-p-hydroxybenzyl-2-methoxy-9,10-dihydrophena nthrene armatuside以及1-p-hydroxybenzyl -4-methoxyphenanthrene-2,7-diol均為實驗室自制(純度≥95%)。

1.3 儀器

LGPABEER型血小板聚集凝血因子分析儀(北京世帝科學儀器公司)；ESI-Q-TOF MS(布魯克道爾頓電噴霧-四極桿-飛行時間質譜儀，包括Metabolite ToolsTM、MDF技術等)；Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統(配有1290 Infinity二元泵，高性能自動進樣器，二級管陣列檢測器，柱溫箱)；Multifuge X3R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；METTLER AE240十萬分之一電子天平(梅特勒-脫利多儀器上海有限公司)。

1.4 供試品配制

1.4.1 標準品

分別稱取上述12種對照品適量，加入甲醇至1 mL超聲溶解，10 000 rpm離心10 min，取上清液于進樣瓶中備用，即得混合標準溶液。

1.4.2 BS-80EE溶液

稱取2 mg的BS-80EE，用甲醇2 mL超聲溶解，10 000 rpm離心10 min，取上清液于進樣瓶中備用。

1.4.3 硫酸魚精蛋白注射液

取適量硫酸魚精蛋白注射劑，用生理鹽水稀釋，配成0.16 mg/mL濃度，臨用前配制。

1.4.4 肝素鈉注射液

取適量肝素鈉注射劑，用生理鹽水稀釋，配成16 U/mL活性濃度，現用現配。

1.4.5 酚磺乙胺注射液

取適量酚磺乙胺注射劑，用生理鹽水稀釋，配成5 mg/L活性濃度，現用現配。

1.4.6 白及各單體化合物

分別稱取白及各單體化合物100 mg或80 mg溶于20 mL生理鹽水中，超聲溶解，配制成5 mg/mL或40 mg/mL濃度，備用。

2 實驗方法

2.1 BS-80EE化學成分分析

2.1.1 色譜條件

色譜柱 Waters BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)柱，柱溫：45 ℃，流動相：0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脫梯度見表1，進樣體積2 μL。

2.1.2 質譜條件

電噴霧電離源(ESI)，掃描方式為正、負離子掃描(ESI+、ESI-，m/z50～1 500)；毛細管電壓(正離子模式4 kV，負離子模式3.5 kV)，錐孔電壓：80 V，離子源溫度：110 ℃，霧化氣(N2)壓力：1.3 bar，流速：6.0 L/min，溫度:200 ℃，脫溶劑氣溫度：300 ℃，氣體體積流量：50 L/h，脫溶劑氣體積流量：550 L/h，準確質量測定采用甲酸鈉校正標準液，校正模式選用：Enhanced Quadratic。數據用HystarPP軟件(BrukerDaltoniks)進行分析。

表1 洗脫梯度表

2.2 ADP、THR誘導的大鼠血小板聚集率的測定

取SD大鼠數只，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，使用3.8%枸櫞酸鈉抗凝真空采血管大鼠腹主動脈釆集血樣。將血樣800 rpm離心10 min，分離上層血漿即得富血小板血漿(PRP)，余下血液部分3 000 rpm離心10 min，分離上層血漿即得貧血小板血漿(PPP)，用PPP調PRP中血小板的計數為(2～3)×1011/L。用PPP調零后，取PRP 290 μL與各單體化合物(5 mg/mL)10 μL于37 ℃共同孵育60 s，加入終濃度為5 μmol/L ADP或10 U/L THR 10 μL，記錄5 min內血小板的最大聚集率。

2.3 肝素化小鼠凝血時間(CT)的測定

取KM小鼠120只(雌雄各半)，隨機分為12組，每組10只，分為空白對照組(control，Con)、模型組(model，Mod)、魚精蛋白組(protamine sulfate，PS)(1.6 mg/kg)、白及各單體(40 mg/kg)。各組小鼠每天尾靜脈給藥1次，空白組、模型組、魚精蛋白組給予生理鹽水20 mL/kg，其余各組給予相應劑量的藥物，連續5天。第5天，給藥60 min后除空白組外均尾靜脈注射肝素鈉，3.2 U/只(魚精蛋白組15 min后尾靜脈注射魚精蛋白)，60 min后用內徑1 mm，長10 cm的毛細玻璃管從小鼠內眼球后靜脈叢取血，待血液充滿玻璃管時開始計時，接著每隔30 s折斷兩端毛細玻璃管(約0.5 cm)，并緩慢向左右拉開，觀察折斷處有無血凝絲出現，從血液充滿玻璃管開始至出現血凝絲所經歷的時間作為小鼠凝血時間(CT),記錄實驗結果。

2.4 統計學方法

3 實驗結果

3.1 BS-80EE中化學成分分析

利用UHPLC-ESI-Q-TOF MS對BS-80EE化學成分進行檢測分析，共表征了18個化學成分(見圖1)。在正離子模式下，通過比較BS-80EE樣品和對照品的保留時間(tR)及質譜數據(見表2)，確定了BS-80EE中的11個化合物(1、5、6、7、8、10、11、14、16、17和18，結構見圖2)；在負離子模式下與對照品的保留時間(tR)及質譜數據對比，確定了6個化合物(1、3、7、8、10和18)。由圖1中的A、C色譜圖可知，BS-80EE中含量較大的化合物有2、3、5、7、8、10、17、18，為BS-80EE的主要成分。

3.2 BS-80EE中單體成分對ADP、THR誘導的大鼠血小板聚集的影響

對BS-80EE中12個化合物進行止血活性評價，由實驗結果可知，與空白組相比，陽性藥酚磺乙胺(etamsylate，Etam))可顯著增加ADP誘導的大鼠血小板聚集率(P<0.01)，對THR誘導的血小板聚集無顯著影響(P>0.05)。

對ADP誘導的大鼠血小板聚集反應，與空白組相比，化合物1、5、7、14和17均可顯著增加血小板聚集率(P<0.05或0.01)，化合物3、10、11、18顯著抑制血小板聚集率(P<0.01)，化合物6、8、16則對血小板聚集反應無顯著影響(P>0.05)(見圖3)。

對THR誘導的大鼠血小板聚集反應，與空白組相比，化合物1、5、6、7、8、11、14和17均可顯著增加血小板聚集率(P<0.05或0.01)，化合物3、18顯著抑制血小板聚集率(P<0.01)，化合物10、16則對血小板聚集反應無顯著影響(P>0.05)(見圖4)。

3.3 BS-80EE中單體成分對肝素化小鼠CT的影響

結合上述BS-80EE化學成分分析結果，我們對能夠獲得單體的化合物進行了肝素化小鼠體內毛細管凝血時間實驗。結果顯示，與空白對照組相比，陽性藥魚精蛋白可顯著縮短肝素化小鼠CT值(P<0.01)，化合物1、3、5、7、8、14和18也可不同程度的顯著縮短肝素化小鼠CT值(P<0.05或0.01)，化合物10、17對肝素化小鼠CT值無顯著影響(P>0.05)(見圖5)。

圖1 BS-80EE(A)和混合標準品(B)在ESI+模式下的TIC色譜圖；BS-80EE(C)和混合標準品(D)在ESI-模式下的TIC色譜圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms of BS-80EE (A) and mixed samples (B) in the positive ion mode;TIC chromatograms of BS-80EE (C) and mixed samples (D) in the negative ion mode

表2 BS-80EE中化合物的色譜和質譜數據

續表2(Continued Tab.2)

圖2 BS-80EE中鑒定出的化合物Fig.2 Compounds identified from BS80EE

圖3 BS-80EE中單體成分對ADP誘導的血小板聚集的影響Fig.3 Effects of different compounds from BS-80EE on platelet aggregation induced by ADP in rats s,n =4)注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

圖4 BS-80EE中單體成分對THR誘導的血小板聚集的影響Fig.1 Effects of different compounds from BS-80EE on platelet aggregation induced by THR in rats s,n=4)注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

圖5 BS-80EE中單體成分對肝素化小鼠CT的影響((x ± s,n =10) Fig.5 Effects of different compounds from BS-80EE on CT of heparinized mice s,n =10)注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

4 討論

超高壓液相色譜-電噴霧-四級桿-飛行時間串聯質譜(UHPLC-ESI-Q-TOF MS)聯用技術是一種同時具備高通量分析檢測及數據快速獲取、處理的新型聯用技術，具有高效、高靈敏度、專屬性強、檢測模式多樣、分析速度快，并提供豐富的數據信息及數據處理的特點，該技術被廣泛用于環境科學、蛋白質組學、中藥化學成分鑒定等研究之中[13-15]。本實驗采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS對BS-80EE中化學成分進行分析，與對照品的保留時間，離子碎片信息進行比對，確認了BS-80EE中12個化學成分。

血小板在生理性止血過程中發揮著重要作用，而血小板活化、聚集是其發揮止血作用的前提。血小板的活化與激動劑密切相關，不同的激動劑激活不同的信號傳導通路，進而引起血小板的聚集程度也有所差異。THR是一種強誘導劑，它可引起不依賴于顆粒內容物的聚集反應；弱誘導劑 ADP若要引起不可逆的聚集反應需要顆粒內容物分泌后的協助作用[16]，兩者均常用于止血、促凝血藥物的體外活性評價模型[16,17]。BS-80EE可顯著增加血小板的聚集作用，故利用ADP、THR誘導的體外血小板聚集實驗對BS-80EE中的主要化合物進行初步止血活性評價，結果顯示化合物1、5、7、8、10、14、17可顯著增加ADP或THR誘導的血小板聚集作用，化合物3、18可顯著抑制ADP及THR誘導的血小板聚集作用，且由圖1A、C可知，化合物5、7、8、17在BS-80EE中的峰面積明顯大于化合物3、18，推測BS-80EE中各化合物對血小板聚集的促進作用之和明顯大于抑制作用，進而使得BS-80EE對血小板聚集表現出促進作用。BS-80EE可顯著縮短肝素化小鼠的CT值，故利用較為經典、常用的止血藥效篩選指標小鼠CT實驗[18]對BS-80EE中主要的且能夠獲得的9個化合物進行體內藥效驗證。結果顯示化合物1、3、5、7、8、14、18均可顯著縮短肝素化小鼠的CT值，化合物10和17對肝素化小鼠的CT值無明顯影響，各化學成分的共同作用使BS-80EE表現出明顯的促凝作用。值得注意的是在體外血小板誘導試驗中，化合物3、18顯著抑制血小板聚集，化合物10、17顯著增加血小板聚集作用，而在體內肝素化小鼠CT實驗時，化合物3、18表現出顯著的促凝作用，10、17則無顯著作用，提示化合物10和17可能只在體外發揮促凝作用或其在體內的促凝作用明顯弱于肝素抗凝作用，而化合物3、18可能抑制血小板系統，但其在體內發揮的共同效應表現出促凝作用，故各個單體化合物的止血作用及機制有待進一步研究。

本研究采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS分析確認了BS-80EE中12個化學成分，進一步利用ADP、THR誘導的血小板聚集實驗和小鼠CT實驗對其主要成分進行初步止血活性評價，發現化合物1、3、5、7、8、10、14、17、18可顯著增加血小板聚集作用或縮短肝素化小鼠凝血時間，初步闡明了BS-80EE的止血活性物質，為白及非多糖組分的深度開發提供了實驗基礎。