重樓皂苷VII抑制肺癌H460細(xì)胞增殖和遷移能力研究

何 昊，錢小英，靳曼菲，王凱迪，鄭 蕾，成 昭

西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，西安 710021

肺癌為臨床最常見的惡性腫瘤疾病之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率在絕大多數(shù)國家和地區(qū)中男性均高于女性。在中國等發(fā)展中國家，由于煙草的使用持續(xù)增加等因素，肺癌的發(fā)病率也在逐步增加[1]。研究表明，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在肺癌中比例超過80%，且5年生存率低于15%[2]，大細(xì)胞肺癌即為其中一種。中醫(yī)藥在治療肺癌方面具有較為悠久的傳統(tǒng)，并積累了較為寶貴的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，中藥能夠通過提高免疫系統(tǒng)功能、降低血液黏度、影響腫瘤細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方式來抑制肺癌細(xì)胞生長，防止肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand-Mazz.或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的干燥根莖[4]。主產(chǎn)于四川、云南、陜西等地，七葉一枝花亦為秦巴山區(qū)特色太白七藥之一，為清熱解毒類中藥。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，重樓中發(fā)揮主要藥效作用的是其中的甾體皂苷類成分，即重樓皂苷。重樓皂苷VII即是其中之一，為具有偏諾皂苷元的皂苷類化合物，有研究顯示其有抗腫瘤活性[5,6]。本研究以人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察重樓皂苷VII作用后對(duì)細(xì)胞增殖、體外遷移、侵襲等的影響，為重樓皂苷應(yīng)用于肺癌及相應(yīng)的藥物開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.1.2 藥品與試劑

重樓皂苷VII購自于成都普菲德生物技術(shù)有限公司(純度≥98%，批號(hào)：76296-75-8)；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國HyClone公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)噻唑藍(lán)(MTT)、Hoechst 33258染料(美國Sigma公司)；Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；MMP-2、MMP-9、caspase-3、ICAD、Bax、Bcl-2、GAPDH抗體(美國Proteintech公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司，Thermo 3111)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司，IX73)；自動(dòng)全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司，Multiskan GO)；分析電子天平(美國OHAUS公司，AX224ZH)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，ChemiDoc XRS+)；western blot系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，Universal)；超純水機(jī)(美國Thermo Fisher公司，MicroPure)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及重樓皂苷VII儲(chǔ)備液的配制

H460細(xì)胞于RPMI-1640完全培養(yǎng)液(10%血清和1%雙抗)中貼壁生長，培養(yǎng)箱條件為37 ℃，5%二氧化碳，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。重樓皂苷VII用DMSO溶解為100 mmol/L的濃度，分裝保存于-20 ℃冰箱，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用完全培養(yǎng)液稀釋成目標(biāo)濃度，并保證DMSO的終濃度低于0.05%，使其不會(huì)對(duì)研究產(chǎn)生顯著影響。

1.2.2 重樓皂苷VII對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

取對(duì)數(shù)生長期H460細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，稀釋至8×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。吸出舊培養(yǎng)液，將重樓皂苷VII用完全培養(yǎng)液稀釋成不同濃度(0、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L)作用于細(xì)胞，每孔100 μL。24 h后，棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌兩次，每孔加入MTT溶液(MTT∶培養(yǎng)液=1∶9)100 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，棄去上清液，加入150 μL DMSO溶解甲臜，選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。按照細(xì)胞抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%，計(jì)算重樓皂苷對(duì)肺癌細(xì)胞H460抑制率及24 h的IC50。

1.2.3 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長期的H460細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×103個(gè)/mL，6孔板中每孔加入2 mL細(xì)胞液，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)液，加入2 mL不同濃度的重樓皂苷VII(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L)，連續(xù)培養(yǎng)20天。20天后除去培養(yǎng)液，每孔用500 μL甲醇固定15 min，PBS清洗2次，加入500 μL 0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗后拍照。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

將H460細(xì)胞懸液接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長后，在各孔細(xì)胞貼壁底部劃痕，并在實(shí)驗(yàn)組各孔分別加入不同濃度的重樓皂苷VII(0.2、0.4、0.8 μmol/L)空白對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)液。并于0、12、24、48 h在倒置顯微鏡下對(duì)劃痕拍照，觀察劃痕內(nèi)細(xì)胞遷移情況。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲能力

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長期的H460細(xì)胞，消化重懸，調(diào)整濃度至2×105個(gè)/mL。Transwell小室中每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，并在下室內(nèi)每孔加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)液，其中含有不同終濃度的重樓皂苷VII(0、0.1、0.2、0.4 μmol/L)，置于培養(yǎng)箱中。24 h后，棄去小室中培養(yǎng)液，PBS清洗后甲醇固定20 min，結(jié)晶紫染色3 min，棉簽擦去小室內(nèi)細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)5個(gè)視野觀察細(xì)胞。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel膠用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液按1∶3稀釋后，均勻鋪于小室底部，于37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育5 h，洗出小室內(nèi)殘余液體，后續(xù)操作同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的H460細(xì)胞，接種于T25培養(yǎng)瓶中，24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，使用含有0.4 μmol/L重樓皂苷VII的完全培養(yǎng)液，分別作用0、12、24、48 h后，收集細(xì)胞，裂解提取蛋白。用12%的SDS-PAGE電泳分離，之后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，洗滌后，使用不同濃度的一抗分別進(jìn)行孵育，過夜。次日洗滌后，使用二抗繼續(xù)孵育1 h，洗滌后使用ECL發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光后，成像曝光條帶，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷VII抑制H460細(xì)胞生長

不同濃度的重樓皂苷VII作用于H460細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組對(duì)比，重樓皂苷VII處理組的細(xì)胞存活率顯著受到抑制，隨著濃度增加，細(xì)胞生長抑制作用也逐漸增強(qiáng)，其24 h的IC50值為0.98±0.24 μmol/L(圖1)。

圖1 重樓皂苷VII抑制H460細(xì)胞生長(n=3)Fig.1 Polyphyllin VII decreases the viability of H460 cells (n=3)

圖2 重樓皂苷VII處理H460細(xì)胞前后形態(tài)對(duì)比Fig.2 The morphology change of H460 cells after treatment of polyphyllin Ⅶ

圖3 重樓皂苷VII對(duì)H460細(xì)胞集落形成的影響Fig.3 The effect of polyphyllin VII on colony formation of H460 cells注：與對(duì)照組相比，**P<0.01。Note:Compared with control group,**P<0.01.

2.2 重樓皂苷VII對(duì)H460細(xì)胞形態(tài)和集落形成的影響

重樓皂苷VII(0.8 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，與空白組相比，采用Hoechst 33258染色觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞存活率顯著下降，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化(圖2)。此外，由圖3可見，隨著重樓皂苷VII濃度增大，H460細(xì)胞形成集落能力越弱，表明H460細(xì)胞集落的形成與重樓皂苷VII濃度呈負(fù)相關(guān)。

2.3 重樓皂苷VII對(duì)H460細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，不同濃度的重樓皂苷VII處理H460細(xì)胞以后，在0、12、24、48 h進(jìn)行觀察，與空白對(duì)照組比較，處理組的細(xì)胞明顯跨越劃痕區(qū)域的速度變慢，劃痕愈合速度降低，說明重樓皂苷VII體外抑制H460細(xì)胞遷移具有濃度和時(shí)間依賴性。

2.4 重樓皂苷VII對(duì)H460細(xì)胞侵襲能力的影響

細(xì)胞Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用不同濃度的重樓皂苷VII處理細(xì)胞24 h后，從小室上層通過聚碳酸酯膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量隨重樓皂苷VII濃度的增加而減少(圖5)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，用不同濃度的重樓皂苷VII處理細(xì)胞24 h后，從小室上層透過基質(zhì)膠進(jìn)一步通過聚碳酸酯膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量也隨重樓皂苷VII濃度增加而減少(圖6)。

2.5 重樓皂苷VII對(duì)H460細(xì)胞凋亡和遷移相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，隨著重樓皂苷VII作用時(shí)間的增加，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)MMP-2和MMP-9表達(dá)顯著降低，提示其可能通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶從而干預(yù)細(xì)胞的遷移侵襲過程(圖7)。此外，凋亡相關(guān)蛋白剪切型caspase-3、Bax表達(dá)均升高，ICAD、Bcl-2表達(dá)含量降低，提示重樓皂苷VII可能誘導(dǎo)H460細(xì)胞發(fā)生了凋亡(圖8)。

圖6 重樓皂苷VII對(duì)H460細(xì)胞小室侵襲作用的影響Fig.6 Effect of polyphyllin VII on H460 cell invasion chamber assays

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有50%以上的抗腫瘤藥物基于天然產(chǎn)物研究而來，多種天然來源的單體或提取成分都被證實(shí)具有抗腫瘤或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用[7,8]，因此，對(duì)于中藥和天然藥物開展研究，尋找具有抗腫瘤作用的單體或成分，具有十分重要的意義。重樓皂苷是提取自中藥重樓的有效成分，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗肺癌作用效果，能通過抑制PI3K-Akt和NF-κB通路誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡[6]。本研究進(jìn)一步表明，重樓皂苷VII具有抑制肺癌細(xì)胞生長的作用，并且能夠體外抑制其遷移和侵襲，還可能誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，同時(shí)，重樓皂苷VII調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲能力可能與其抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs相關(guān)。MMPs是一類細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解酶，在多種惡性腫瘤中均過表達(dá)，其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、遷移、侵襲，以及促進(jìn)腫瘤血管新生等作用[9]。MMP-2和MMP-9是兩種主要的MMPs，同樣具有降解ECM，促進(jìn)腫瘤遷移侵襲的作用[10]。本研究表明，重樓皂苷VII抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用與其調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9的表達(dá)相關(guān)，同時(shí)，重樓皂苷VII還能夠調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白。CAD(caspase-activated deoxyribonuclease)是凋亡過程中使細(xì)胞核中DNA降解的一種酶，ICAD(inhibitor of CAD)則對(duì)其發(fā)揮抑制作用，在正常狀態(tài)下兩者均存在于胞漿中，維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)[11]。重樓皂苷VII作用后，ICAD表達(dá)降低，從而使CAD抑制作用被減弱，發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用。Bcl-2家族是凋亡過程的重要參與者，其中Bax可促進(jìn)凋亡的發(fā)生，Bcl-2則抑制凋亡的發(fā)生[12]。重樓皂苷VII作用后，Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，最終達(dá)到活化caspase家族蛋白并啟動(dòng)凋亡程序的目的。Caspase-3是最終的凋亡執(zhí)行蛋白，其被活化剪切后，誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生[13]。綜上所述，重樓皂苷VII能夠顯著抑制肺癌H460細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，其機(jī)制與調(diào)節(jié)MMPs家族蛋白并最終誘導(dǎo)凋亡相關(guān)，本研究豐富了重樓皂苷抗腫瘤研究的相關(guān)基礎(chǔ)，為重樓皂苷的進(jìn)一步研究開發(fā)提供了參考。

圖7 重樓皂苷VII對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的影響Fig.7 Effect of polyphyllin VII on MMPs

圖8 重樓皂苷VII對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.8 Effect of polyphyllin VII on apoptosis-associated proteins