羊肝蛋白穩定性及NaCl質量分數對其功能特性的影響

張曉燕 吳子健 陸健康 侯惠靜 柳昊杰 孟令莉 趙穎濤

(1. 天津商業大學生物技術與食品科學學院天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2. 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843399；3. 天津天獅學院食品工程學院，天津 301700；4. 天津商業大學藝術學院，天津 300134)

肝臟是肉制品加工后廉價的副產物，含有大量的蛋白質和豐富的營養元素，如：氨基酸、礦物質和脂肪酸等[1-2]。由于缺乏對羊肝蛋白質功能特性的研究，使得其利用局限于肝醬制品和動物飼料。與雞肝和豬肝相比，羊肝中不僅含有豐富的微量元素(如Cu、Fe)和必需脂肪酸(如γ-亞麻酸)，而且含有大量維生素和蛋白質(17.90 g/100 g·羊肝)[3-4]，使得其具有抗氧化、抑制脂質過氧化、抗腫瘤以及提高機體免疫力等功能[5]。目前有關羊肝的研究基本集中在產品開發和工藝優化等方面，例如：韓志慧等[6]將利用發酵和脫膻法去除了膻味羊肝與具有明目功效的營養液混合，研制得到了新型的羊肝羹；李黎等[7]研制和開發了具有明目功效的羊肝口服液，并對其工藝參數進行優化；張宇[8]優化了羊肝蛋白的提取工藝，并考察其抗氧化活性；文飛[9]優化了羊肝蛋白多肽的制備工藝，并考察其抗氧化活性，未見NaCl含量對羊肝中不同蛋白組分功能特性影響的報道。

試驗擬研究羊肝蛋白的穩定性及NaCl含量對水溶性羊肝蛋白(Water soluble liver proteins，WSLP)和鹽溶性羊肝蛋白(Salt soluble liver proteins，SSLP)的乳化性、起泡性，以及其分子量分布和表面疏水性，以期為羊肝蛋白的加工利用提供數據支持與理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料前處理

選取新鮮美利奴羊羊肝，手工除去血管和脂肪組織，然后分割成300 g左右的組織塊，真空包裝后，貯存于-40 ℃ 下直至分析。

1.2 試劑

磷酸氫二鈉、氯化鈉：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；

磷酸二氫鈉：分析純，天津風船化學試劑科技有限公司；

十二烷基硫酸鈉：分析純，天津博迪化工股份有限公司；

三(羥甲基)氨基甲烷：分析純，上海山浦化工有限公司；

考馬斯亮藍G-250：分析純，上海藍季科技發展有限公司。

1.3 儀器與設備

高壓均質機：AH100B型，加拿大ATS公司；

納米粒度分析儀：Zetasizer Nano-ZS 90型，英國Malvern公司；

離心機：3-18K型，德國Sigma公司；

真空冷凍干燥機：日本EYELA公司；

熒光分光光度計：FL970型，香港Techcomp公司；

垂直電泳系統：SE 260型，美國Hoefer公司；

超微量紫外分光光度計：NanoPhotometer-N50型，德國IMPLEN公司；

凝膠成像系統：Essential V6型，英國Uvitec公司；

差示掃描量熱儀(DSC)：STA 449F3型，耐馳科學儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 羊肝基礎指標的測定

(1) 羊肝粗蛋白含量：凱氏定氮法[10]。

(2) 脂肪含量：索氏提取法[11]。

1.4.2 羊肝蛋白提取 取冷凍羊肝4 ℃下過夜放置融化后組織研磨，加入4倍體積的4 ℃的0.05 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7.4)，室溫下振蕩提取30 min后，于4 ℃離心(10 000×g)15 min，收集上清液，沉淀重復上述提取步驟兩次，合并3次提取的上清液即為WSLP水溶液；取提取WSLP的沉淀加入4倍體積0.60 mol/L NaCl溶液(0.05 mol/L、pH 7.4的磷酸鈉緩沖液)，按上述步驟提取合并上清液即為SSLP溶液；所得WSLP溶液和SSLP溶液置于4 ℃下透析(透析膜的分子截留量為8 000～13 000 kDa) 48 h[12]。

1.4.3 十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 參照文獻[13]，具體參數：分離膠12%、濃縮膠5%、樣品蛋白質量濃度1.5 mg/mL，上樣量7 μL，電壓200 V、電泳時間40 min左右。

1.4.4 熱穩定性 根據李艷青[14]的方法采用差示掃描量熱儀(DSC)測定。稱取5～8 mg蛋白樣品于鋁盒中，使用空置鋁盒作為空白。設置參數為：測定溫度20～150 ℃，加熱速度10 ℃/min，采用pyris6.0軟件進行數據采集。

1.4.5 蛋白粒徑及Zeta電位的測定 采用納米粒徑分析儀測定，設置參數為：蛋白質量濃度1 mg/mL；使用配有He/Ne激光器，λ=633 nm。

1.4.6 表面疏水性的測定 取4.0 mL蛋白溶液(質量濃度范圍為0.01～0.05 mg/mL)加入20 μL的8.0 mmol/L ANS試劑，室溫下反應1.0 min后測定其熒光吸收值，熒光分光光度計設備參數為：激發波長370 nm、發射波長490 nm、夾縫5 nm、掃描速率60 nm/s。以未加ANS的蛋白溶液為空白，然后以熒光強度為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標作圖，其斜率即可反映蛋白質的表面疏水性(Ho)[15]。

1.4.7 乳化性(EAI)及乳化穩定性(ESI)的測定 提取的羊肝蛋白溶于NaCl溶液中至蛋白質量濃度為1.0 mg/mL，并以4∶1(V羊肝蛋白鹽溶液∶V大豆油)的比例加入大豆油，均質(轉速為10 000 r/min)1 min立即從底部取100 μL均質后溶液，并加入10.0 mL十二烷基硫酸鈉溶液(0.1%、pH 7.0)，混合均勻，測定500 nm下的吸光度記為A0，10 min 后，重復之前操作，測定吸光度，記為A10。分別按式(1)和式(2)計算乳化性指數(Emulsifying activity index，EAI)、乳化穩定性指數(Emulsifying stability index，ESI)[16-17]。

(1)

(2)

式中：

IEA——乳化性指數，m2/g；

IES——乳化穩定性指數，min；

φ——油相體積分數(油的體積/乳化體系的體積)，25%；

C——樣品蛋白質含量，mg/mL；

A0、A10——乳化體系在0，10 min時的吸光度；

N——稀釋倍數，100。

1.4.8 起泡性(FA)及泡沫穩定性(FS)的測定 使用NaCl溶液調節蛋白溶液的質量濃度為2.0 mg/mL，記錄起始溶液體積為V0，以10 000 r/min均質2 min，測量蛋白溶液和泡沫的總體積，計為V1，30 min后，再次測量蛋白溶液和泡沫的總體積，計為V2。分別按式(3)、(4)計算起泡性(Foaming activity，FA)、泡沫穩定性(Foaming stability，FS)[18]。

(3)

(4)

式中：

AF——起泡性，mL/g；

SF——泡沫穩定性，%；

V0——初始時的液面高度，cm；

V1——均質后的液面高度，cm；

V2——靜置30 min后的液面高度，cm。

1.5 統計分析

每組試驗重復3次，每次試驗測定3個平行樣，結果用SPSS 25.0進行分析處理(P<0.05)，數據作圖采用OriginPro8.1軟件。

2 結果與分析

2.1 羊肝蛋白的基本表征

經試驗測定，羊肝中的粗蛋白質量分數為18.76%，其中WSLP的蛋白質純度達到90.528%，SSLP的蛋白質純度達到70.564%，脂肪質量分數為2.19%。

2.2 SDS-PAGE電泳

如圖1所示：以Mark為參照，WSLP包含各種高分子量和低分子量的蛋白質，在20～100 kDa的低分子量范圍內發現多個條帶，主要的蛋白條帶分別為34，46，52，63，77 kDa。肌漿蛋白是分子量相對較低的水溶性球狀蛋白，主要由糖酵解途徑的酶，肌酸激酶和血紅素色素組成[19]。WSLP的SDS-PAGE圖中還顯示了幾種高分子量蛋白質，其中主要蛋白質約為110 kDa，它們可能是成肌纖維的片段[20]。

SSLP的SDS-PAGE圖譜中顯示出高分子量和低分子量的蛋白質。主要的蛋白條帶分別為72，63，60，42，101 kDa，然而，與WSLP相比，在低分子量范圍內發現較少的蛋白質條帶，而在高分子量范圍內發現較多的蛋白質條帶，SSLP的分子量分布與Nuckles等[21]的研究相似。Steen等[22]將42 kDa的弱條帶認為是肌動蛋白條帶，試驗也具有相似推斷。WSLP和SSLP的SDS-PAGE圖譜中有相似分子量的譜帶，可能是由蛋白質在磷酸鹽和NaCl磷酸鹽溶液中的部分溶解性所致，也可能是存在具有相同分子量的不同蛋白質[23]。

2.3 熱穩定性

由圖2可知，WSLP和SSLP的變性溫度分別在74.4 ℃ 和87.9 ℃左右，SSLP的熱穩定性高于WSLP。

2.4 羊肝蛋白的粒徑和Zeta電位

由圖3(a)可知，WSLP的粒徑在100～1 000 nm處有較為集中的分布。而SSLP的分別在0～100，100～1 000 nm 出現分布，其中在100～1 000 nm出現的單峰，與WSLP的粒徑分布很相似。

圖1 鹽溶性與水溶性羊肝蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Figure 1 The image of protein gel electrophoresis

圖2 羊肝蛋白的DSC分析曲線Figure 2 DSC analysis curve of sheep liver protein

圖3 羊肝蛋白的粒徑和電位分析圖Figure 3 Particle size and potential analysis of sheep liver protein

由圖3(b)可知，SSLP的Zeta電位總數高于WSLP的，靜電相互作用較強，表明SSLP可能更加穩定。

2.5 NaCl質量分數對羊肝蛋白表面疏水性的影響

由表1可知：當NaCl質量分數為0.0%～3.6%時，WSLP和SSLP兩類蛋白的表面疏水性會隨NaCl質量分數的提高而增加；未添加NaCl時，WSLP的表面疏水性較SSLP低，而NaCl質量分數為1.8%和3.6%時WSLP的表面疏水性卻明顯高于SSLP，說明NaCl質量分數對WSLP蛋白表面疏水性的影響程度較SSLP的要大。WSLP主要為各種肌漿球蛋白，特別是肌球蛋白相關蛋白，鹽離子的添加會使得原本處于蛋白質內部的疏水性氨基酸殘基的側鏈逐漸暴露于蛋白的外部[24]。帶負電荷的Cl-會削弱水分子與蛋白分子間的氫鍵，促進水分的遷移，進而影響溶液體系中水分的分布；同時Cl-會與肌漿球蛋白絲中帶正電荷的氨基酸殘基側鏈結合，削弱原有蛋白分子內的離子鍵，改變蛋白結構，促使蛋白分子中疏水基團暴露于蛋白的表面，進而增加其表面疏水性[25]。另外，SSLP主要為各種肌原纖維蛋白，而通常NaCl會促進SSLP各蛋白質的溶解，Thawornchinsombut等[26]研究結果表明魚的肌原纖維蛋白在NaCl濃度低于0.6 mol/L (3.5%)時，蛋白的表面疏水性沒有顯著變化，當NaCl濃度高于0.6 mol/L時，其表面疏水性顯著增加。

2.6 NaCl質量分數對羊肝蛋白乳化性與乳化穩定性的影響

由圖4(a)可知：WSLP和SSLP乳化性隨NaCl質量分數(0.0%～3.6%)的增加而降低；未添加NaCl以及NaCl質量分數為1.8%時，WSLP的乳化性均明顯高于SSLP，而NaCl質量分數為3.6%時，WSLP的表面疏水性略低于SSLP，說明NaCl質量分數對WSLP乳化性的影響較SSLP的大。

表1 NaCl質量分數對WSLP和SSLP蛋白表面疏水性的影響

小寫字母不同表示同一蛋白源不同鹽濃度間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同一鹽濃度不同蛋白源間差異顯著(P<0.05)圖4 NaCl質量分數對羊肝蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Figure 4 Effect of NaCl concentration on emulsification and emulsification stability of sheep liver protein

由圖4(b)可知：不添加NaCl時，WSLP的乳化穩定性高于SSLP；而NaCl質量分數在1.8%和3.6%時，WSLP的乳化穩定性比SSLP的低。這是由于能夠遷移到油水界面的蛋白質量降低或蛋白質從界面向連續相的擴散增加導致的，與靜電、水合排斥和界面上吸附的蛋白分子之間的空間相互作用有關[27]。Silva等[28]觀察到，隨著NaCl質量分數(0.0%～1.6%)增加乳液的乳化性降低，可能是由于乳液形成后蛋白質從界面到連續相的擴散增加。Khalid等[29-30]認為NaCl質量分數較低時(0.2%～1.0%)鷹嘴豆和芝麻籽乳化能力的提高，是因為溶解度的提高，而在較高的鹽離子質量分數下(1.2%～2.0%)乳化能力的降低，是由于鹽析效應。

2.7 NaCl質量分數對羊肝蛋白起泡性與泡沫穩定的影響

由圖5可知：NaCl質量分數為0.0%～3.6%時，WSLP和SSLP的起泡性和泡沫穩定性均呈先增加后降低的趨勢。當NaCl質量分數為1.8%時，WSLP和SSLP的起泡性和泡沫穩定性顯著增加，因為此時兩種蛋白的表面疏水性增加(如表1所示)，蛋白質在空氣/水界面處的相互作用增強，但當NaCl質量分數為3.6%時，WSLP和SSLP的起泡性顯著下降，是因為疏水性氨基酸殘基向外部空間暴露太多時，蛋白質分子間疏水相互作用增強，進而發生凝聚導致產生空氣與水界面蛋白薄膜的蛋白量減少，引發起泡性下降，如Zouari等[31]研究結果顯示添加1%的NaCl可提高火雞肝臟蛋白的起泡性，而當NaCl添加量為2%時，起泡性顯著降低。Zou等[32]研究表明起泡性和泡沫穩定性會影響肝醬產品的加工及貯藏。

小寫字母不同表示同一蛋白源不同鹽濃度間差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示同一鹽濃度不同蛋白源間差異顯著(P<0.05)圖5 NaCl質量分數對羊肝蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響Figure 5 Effect of NaCl concentration on foaming property and foam stability of sheep liver protein

3 結論

經提取后的羊肝中含有90.528%的水溶性蛋白和70.564%的鹽溶蛋白。水溶性羊肝蛋白的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜以低分子量為主，而鹽溶性羊肝蛋白在高分子量范圍的條帶較多。羊肝鹽溶蛋白的熱穩定性較高，且粒徑分布也較為集中，說明鹽溶蛋白的穩定性較高，電位分析也可驗證這一結果。添加NaCl可顯著降低羊肝水溶蛋白和鹽溶蛋白的乳化性和乳化穩定性，而起泡性和泡沫穩定性發生顯著的先增加后降低的趨勢。