QuEChERS凈化—氣相色譜—質譜法測定食用植物油中4種合成抗氧化劑

鄭鴻濤 劉子雄 魏 榮 謝國丹 董 海 譚貴良

(1. 中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437；2. 電子科技大學中山學院，廣東 中山 528402)

油脂是人體必不可少的一種重要營養素。食用植物油經精煉加工后，天然存在的抗氧化成分(如維生素E)會大量損失[1-2]；在貯藏、使用過程中，也極易與空氣中的氧氣發生氧化反應，引起油脂酸敗變質，從而產生對人體有毒有害物質。油脂氧化是造成油脂變質的主因，目前常用的阻止氧化反應發生的方法是向油脂中添加抗氧化劑[3-4]，其中，合成抗氧化劑有2，6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)(其結構式見圖1)等。動物試驗[5-7]表明，高劑量的苯酚類抗氧化劑會造成細胞凋亡、DNA裂解等潛在健康危害，隨著食品毒理學方法的發展，目前被認為無害的食品添加劑可能存在慢性毒性和致畸、致突變、致癌性的危害。因此，國家衛計委在GB 2760—2014中對抗氧化劑在食用植物油中的最大使用量作出了嚴格的限定。

GB 5009.32—2016《食品安全國家標準 食品中9種抗氧化劑的測定》是檢驗檢測機構現行采用的抗氧化劑的國標檢測方法。該標準的前處理凈化過程主要依賴于凝膠滲透色譜(GPC)，其操作繁瑣，有機溶劑消耗多，對環境污染大，一次性處理樣品量較少，無法實現高通量處理，而且GPC在各實驗室中的應用尚未普及。文獻[8-10]采用高效液相色譜(HPLC)法檢測食用油脂中的多種抗氧化劑，但其中涉及的前處理方法多采用液液分配直接進樣，其過程需接觸大量有機溶劑；柱層析或固相萃取(SPE)凈化，需先對樣品進行萃取和濃縮，再通過柱層析凈化，耗時較長。QuEChERS是一種快速、簡單、低成本的樣品前處理技術[11]。該技術很好地解決了傳統前處理方法操作繁瑣、環境污染大等問題，已被廣泛應用于食品中農藥殘留[12-13]和真菌毒素檢測[14-15]等方面，但應用在同時測定花生油等多種油脂基質中抗氧化劑的報道尚未見。景贊等[16]采用QuEChERS-氣相色譜—串聯質譜質法(GC-MS/MS)檢測了花椒油中3種抗氧化劑(BHA、BHT、TBHQ)，結果表明樣品經QuEChERS凈化后可有效去除干擾物質，基質效應較小，但該方法中的串聯質譜儀(MS/MS)設備昂貴，且檢測對象單一。研究擬采用QuEChERS前處理技術結合氣相色譜—質譜聯用(GC/MS)法開發一種快速檢測七大類食用植物油(花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油和調和油)中4種合成抗氧化劑的方法，并對市售的21批次食用植物油進行檢測，旨在為相關市場監管部門對此類產品的監管提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、調和油7類食用植物油：市售；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管(5982-1010)、EMR-Lipid polish反萃取管(5982-0101)：美國安捷倫科技有限公司；

圖1 4種合成抗氧化劑的結構式Figure 1 Structural formula of 4 synthetic antioxidants

2，6-二叔丁基對甲基苯酚(BHT)標準品：純度98.8%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

叔丁基對羥基茴香醚(BHA)標準品：純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

叔丁基對苯二酚(TBHQ)標準品：純度97.7%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

2，6-二叔丁基-4-羥甲基苯酚(Ionox-100)標準品：純度99.1%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜—質譜聯用儀：7890B/5977A型，配EI離子源，美國安捷倫科技有限公司；

冷凍離心機：3-18K型，德國Sigma公司；

數顯型渦旋混勻器：MS 3 digital型，德國IKA公司；

超聲儀：SCQ-7201E型，上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

(1) 樣品提取：稱取1 g(精確至 0.001 g)食用植物油于50 mL離心管中，加入10 mL正己烷飽和的乙腈(或甲醇、無水乙醇、乙腈)，3 000 r/min渦旋震蕩2 min，超聲提取15 min，于3～8 ℃、10 000 r/min離心3 min，取上層液備用。

(2) 樣品凈化：移取5 mL上層液于EMR-Lipid dSPE凈化管(凈化管需先用1 mL純水活化)，3 000 r/min渦旋震蕩2 min，冷凍離心。

(3) 樣品反萃取：取凈化離心后的上層液(陰性樣液)3～4 mL分別加入到5982-0101、5982-0102兩種反萃取管中，3 000 r/min渦旋震蕩2 min，冷凍離心，上層液過0.22 μm 尼龍濾膜，收集濾液于樣品瓶中供GC/MS分析，考察不同組合QuEChERS對陰性樣品的凈化效果。

1.2.2 儀器分析條件

(1) 色譜條件：DB-35MS毛細管色譜柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL；柱流速1.0 mL/min；載氣為高純氦氣(≥99.999%)；程序升溫：90 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至140 ℃，保持9 min，以30 ℃/min升溫至280 ℃，保持3 min。

(2) 質譜條件：MSD傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為EI；電子轟擊能量70 eV；溶劑延遲6 min；掃描方式為全掃描m/z50～550，掃描速率3.125 amu/s；數據采集類型為SIM，選擇離子峰面積外標法進行測定。

1.2.3 基質效應評價 參照蘇萌等[17-18]的方法。用乙腈溶劑配制標液將花生油等7種空白食用植物油基質在線性范圍內配制成低、中、高不同濃度的基質標液進行測試，評價4種合成抗氧化劑在各種食用植物油中產生的基質效應。

1.2.4 線性方程、檢出限與定量限測定 取7種食用植物油陰性樣品，采用基質加標曲線外標法定量，按1.2.1的方法進行前處理，制備0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的基質混合標準工作溶液，上機測定，以標準溶液濃度為橫坐標、響應值為縱坐標繪制校準曲線。以定量離子信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)時的響應定義4種抗氧化劑的方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

1.2.5 準確度與精密度測定 采用菜籽油等7種不同類型空白食用植物油基質，通過加標測試計算各抗氧化劑在不同食用植物油中的回收率，以此驗證方法的準確度；以5 μg低濃度添加水平在不同食用植物油基質中進行測試，計算各抗氧化劑在不同食用植物油基質中6次平行測試結果的相對標準偏差，以此驗證方法的準確度。

1.2.6 實際樣品驗證 用試驗建立的方法對市售的花生油、菜籽油、玉米油、芝麻油、大豆油、葵花籽油、調和油七大類食用植物油共21批次進行上機檢測，驗證試驗方法的準確性。

1.2.7 數據處理 使用安捷倫MSD ChemStation、Mass Hunter Workstatiom Software工作站軟件對研究的4種合成抗氧化劑的定量離子進行數據處理，峰面積外標法定量，保留時間和定性離子進行定性；用Excel軟件對樣品含量、精密度、回收率數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理過程優化

試驗的4種合成抗氧化劑均為極性物質，極易溶于油脂及有機溶劑，如甲醇、無水乙醇、乙腈等。選用甲醇、無水乙醇、乙腈3種溶劑作為萃取劑，以加標回收方式進行比較，均獲得了不錯的提取效果，但萃取凈化后甲醇萃取管壁上仍有掛壁油狀殘留物，說明乙醇和乙腈作為食用油中抗氧化劑的萃取劑其效果優于甲醇，但由于乙醇極易揮發，不適合批量樣品的檢測，最終選擇不易揮發的乙腈作為研究抗氧化劑的萃取劑。參照GB 5009.32—2016以及Chattetjee等[19-20]的方法，由于正己烷和乙腈具有一定的互溶性，萃取前先將乙腈用正己烷進行飽和處理，經正己烷飽和的乙腈提取樣品中抗氧化劑時，可以減少萃取樣品中油脂等非極性的組分，從而達到更好的去脂效果，為后續EMR-Lipid dSPE凈化處理減負。由圖2 可知，5982-0101反萃取管的凈化效果較5982-0102反萃取管的更為顯著，因此采用5982-0101反萃取管進一步除脂凈化。

2.2 基質效應評價

當基質效應為80%～120%時，基質效應較弱，可忽略；當基質效應<80%或>120%時，存在很強的基質抑制或增強效應，需用基質匹配曲線進行校正。由圖3可知，4種合成抗氧化劑在各食用植物油中的基質效應(增強或抑制)基本一致；各抗氧化劑濃度的變化對基質效應的影響不顯著；BHT、TBHQ、Ionox-100存在較強的基質增強效應，BHA的基質效應并不明顯。為了盡可能地降低基質效應的干擾，采用空白基質配制標準曲線對目標物進行定量分析。

圖2 經兩種不同反萃取管凈化后的食用植物油總離子流色譜圖Figure 2 Chromatogram of total ion flow of edible vegetable oil purified by two different reverse extraction tubes

圖3 4種合成抗氧化劑的基質效應評價Figure 3 Matrix effect evaluation of 4 synthetic antioxidants

2.3 色譜條件優化

分別選用HP-1MS、HP-5MS、DB-35MS 3種毛細管色譜柱(柱長均為30 m)進行試驗，結果表明，3種色譜柱均能分離出4種抗氧化劑，但HP-1MS、HP-5MS毛細管色譜柱的響應值較DB-35MS的低，且分離TBHQ時峰拖尾現象較為嚴重，影響低濃度目標物的分析；采用DB-35MS分析4種抗氧化劑時，其響應值、分離度和峰對稱性均較好，因此選用DB-35MS毛細管色譜柱進行分析，并對色譜分離條件進行優化，測試分析得到4種合成抗氧化劑的標準離子流色譜圖如圖4所示。由圖4可知，DB-35MS毛細管色譜柱在17 min內能有效分離4種合成抗氧化劑，其分離度好、分析時間短且能夠滿足方法要求。

2.4 質譜條件優化

根據質譜圖上各碎片離子的響應豐度，選擇3～5個豐度較高、質荷較大的離子進行SIM檢測以保證檢測結果的靈敏度和準確性。圖5為BHT、BHA、TBHQ、Ionox-100 4種合成抗氧化劑全掃描得到的離子碎片圖，由圖5可知，離子205.1、165.1、166.1、221.1具有較高的響應豐度和較大的質荷比，可作為定量離子，220.2、206.2、180.1、137.0、123.0、151.1、236.1、222.2響應豐度也較高，可作為定性離子；駐留時間的設定要確保每個目標峰輪廓光滑，峰面積穩定，最終確定如表1的質譜參數為研究試驗的質譜參數。

圖4 4種合成抗氧化劑選擇離子TIC疊加圖Figure 4 Stack of four synthetic antioxidants selected by ion TIC

圖5 4種合成抗氧化劑離子碎片圖Figure 5 Four synthetic antioxidant ion fragments

表1 4種合成抗氧化劑的質譜參數表

2.5 線性方程、檢出限與定量限

由表2可知，4種合成抗氧化劑在0.5～20.0 μg/mL內呈良好的線性關系，相關系數R2均>0.999；4種抗氧化劑的檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg，符合分析技術要求。

2.6 準確度與精密度

由表3可知，4種合成抗氧化劑在低、中、高各添加水平的加標回收率為84.1%～108.0%。由表4可知，各種食用植物油的相對標準偏差RSD為0.4%～4.5%，說明試驗方法具有較高的準確度和精密度。

表2 4種合成抗氧化劑的檢出限、定量限、線性范圍及相關系數

表3 4種合成抗氧化劑在不同食用植物油基質中的加標回收率

表4 4種合成抗氧化劑在不同食用植物油基質中的精密度

2.7 實際樣品分析

實際樣品檢測發現，BHT和BHA各檢出1批次，TBHQ檢出9批次，其含量為50～120 mg/kg，低于GB 2760—2014允許的最大添加量200 mg/kg，說明中國食用植物油所添加的抗氧化劑中，毒性偏強的BHA、BHT、Ionox-100正逐漸被毒性較小的TBHQ所替代。同時對購自廣州譜恩科學儀器有限公司的食用油質控樣品進行了驗證，并與GB 5009.32—2016中涉及的凝膠滲透色譜(GPC)-GC/MS方法進行了比較，其結果見表5。由表5可知，試驗開發的方法與GPC-GC/MS的檢測結果均落在質控樣品測試結果滿意區間內，且無明顯差異，表明開發的檢測方法獲得的檢測數據準確可靠，且新方法的工作效率較國標法有明顯的提升。

表5 采用不同方法得到的質控樣品分析結果

3 結論

研究結果表明，運用QuEChERS前處理技術對食用植物油基質進行提取和凈化，可以很好地解決脂質去除和分析物回收之間兩難的問題，所建方法與采用固相萃取、凝膠滲透色譜凈化效果相同；且可以實現高通量處理，其工作效率更高；此外研究對各類食用油脂中的抗氧化劑進行了檢測方法分析，其檢測類別廣、覆蓋面全。研究方法的自動化程度高，操作簡單、有機溶劑使用量少、對環境友好、油脂去除效果顯著、靈敏度、精密度及回收率均可滿足國內外相關標準對食用植物油中抗氧化劑的限量要求。在QuEChERS樣品前處理過程中，試驗僅對商品化的EMR-Lipid dSPE增強型脂質去除凈化管、EMR-Lipid polish反萃取管進行研究，未對其內在各成分展開深入探討，后續可通過改良QuEChERS組合中的成分尋求更佳試驗方案。